實(shí)驗(yàn)原理
DNA重組是將外源DNA與載體分子連接,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子.DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法. 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中,將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接.常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起,而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái),但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率.
如果是單酶切,為了防止載體本身的自身連接,可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理,去掉酶切后5'端的磷酸.這樣做能有效防止質(zhì)粒的自身環(huán)化,降低轉(zhuǎn)化的背景,大大提高重組子的篩出效率.
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性,但是在這樣的溫度下,粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的.一般的連接條件是在12-16℃,反應(yīng)12-16小時(shí)（過(guò)夜）,這樣既可zui大限度地發(fā)揮連接酶的活性,又兼顧到粘性末端短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后,還須對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定,挑選出所需的重組質(zhì)粒.
儀器、材料與試劑
一、儀器
1．恒溫?fù)u床
2．恒溫水浴
3．恒溫培養(yǎng)箱
4．小型高速離心機(jī)
二、材料
1． 氨芐*
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA連接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 質(zhì)粒
6． 培養(yǎng)皿
7． 接種針
8． 金屬涂棒
9． 1.5mL 離心管
10．酒精燈
11．鑷子、滅菌牙簽等
三、試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒
實(shí)驗(yàn)步驟
一、質(zhì)粒DNA
提取的pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒.
二、制備重組DNA
1. 在滅菌的1.5mL 離心管中,加入pQE-31質(zhì)粒10mL（2mg／mL）,2mL酶切緩沖液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10個(gè)單位）,無(wú)菌雙蒸水7mL,至反應(yīng)混合物總體積為20mL,離心混勻,37℃反應(yīng)過(guò)夜.
2. 在另一無(wú)菌1.5mL 離心管中,加pUC18-CAT 質(zhì)粒20mL,加入3mL酶切反應(yīng)液,lmL BamHI和HindIII酶的混合液,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)到30mL,37℃反應(yīng)過(guò)夜.
3. 反應(yīng)完畢后取5mL pQE-31質(zhì)粒的酶切液做電泳分析,檢驗(yàn)酶切是否*.酶切*,進(jìn)行下一步.
4. 將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒,分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳（注意加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）.電泳結(jié)束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法回收DNA片段.前者回收的片段為3.5kb,后者為650bp.
5. 將回收的pQE-31載體質(zhì)粒均分為兩份,其中一份與酶切后回收的CAT片段混合,做連接；另一份不加CAT片段,做對(duì)照.操作如下：
在10mL DNA樣品中,加T4 DNA連接酶緩沖液1mL,T4 DNA連接酶1mL,14℃（室溫）過(guò)夜,然后做大腸桿菌的轉(zhuǎn)化.
三、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
1. 制備的感受態(tài)細(xì)胞（-20℃保存的）.
2. 在100mL的融化后處于冰浴的感受態(tài)細(xì)胞中,加入10mL連接產(chǎn)物,混勻,冰上放置30分鐘,以后的操作參照實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行.同時(shí)做未加CAT片段的空白pQE-31載體質(zhì)粒連接處理后的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的對(duì)照.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
過(guò)夜培養(yǎng)后,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的兩個(gè)培養(yǎng)皿上都可能會(huì)出現(xiàn)一些菌落.如果實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)明顯多于對(duì)照組的菌落,則是好征兆,但實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)的菌落是否含有所需的DNA重組子還須進(jìn)一步鑒定.