三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中*侵襲性的一種，由于不表達(dá)激素受體以及HER2，無法使用靶向治療，長期以來TNBC患者只能接受手術(shù)以及放化療

免疫檢查點抑制劑療法的出現(xiàn)為TNBC患者帶來了新的希望，然而臨床試驗發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑聯(lián)合化療僅能使一小部分TNBC患者獲益[1,2]。因此，探究TNBC對免疫檢查點抑制劑治療耐藥的機(jī)制至關(guān)重要，這將為改善免疫治療效果提供參考。

近期，由Dana-Farber癌癥中心Judith Agudo教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊在Cell期刊發(fā)表重要研究成果[3]，他們發(fā)現(xiàn)在TNBC中有一群抵抗T細(xì)胞殺傷的靜息腫瘤細(xì)胞（QCCs）。這些QCCs通過激活HIF1a，與免疫抑制性成纖維細(xì)胞、功能失調(diào)的DC細(xì)胞一起形成了一個抵御T細(xì)胞浸潤與殺傷的微環(huán)境。從而在免疫治療中存活下來并引起腫瘤復(fù)發(fā)。

這項研究成果為我們揭開了乳腺癌免疫逃逸的神秘面紗，突出了QCCs在乳腺癌免疫逃逸中的重要作用，提示我們靶向清除QCCs可能是破解TNBC免疫耐藥難題的有效途徑。

以往有研究發(fā)現(xiàn)一些基因在腫瘤細(xì)胞抵抗免疫治療中具有一定作用[4,5]，但是這些研究并不能解釋腫瘤細(xì)胞是如何營造出一個免疫抑制性微環(huán)境的；此外，通過測序的手段能夠找到對免疫檢查點抑制劑治療耐藥腫瘤所具備的一些特征，但是腫瘤組織中存在大量異質(zhì)性的細(xì)胞群體，這大大增加了尋找腫瘤耐藥機(jī)制的難度。例如丟失腫瘤抗原的癌細(xì)胞與腫瘤抗原陽性的癌細(xì)胞在逃脫免疫系統(tǒng)追殺過程中采取的方法顯然是不同的。

在這項研究中，Agudo教授團(tuán)隊希望探究那些表達(dá)腫瘤抗原的癌細(xì)胞是怎么逃脫免疫系統(tǒng)的追殺的。因此，他們?yōu)樾∈蠼臃N了表達(dá)GFP或mCherry的TNBC細(xì)胞系4T07，并為小鼠轉(zhuǎn)輸特異性識別GFP的PD-1-/-Jedi T細(xì)胞(敲除PD-1是為了模擬PD-1抑制劑治療)。由于Jedi T細(xì)胞的TCR只能特異性識別GFP而不能識別mCherry。因此該實驗?zāi)Ｐ涂梢杂脕硖骄砍掷m(xù)表達(dá)腫瘤特異性抗原的腫瘤細(xì)胞(GFP+腫瘤細(xì)胞)是如何逃脫腫瘤抗原特異性T細(xì)胞(Jedi T細(xì)胞)的攻擊。

研究團(tuán)隊在轉(zhuǎn)輸Jedi T細(xì)胞后第5天分析腫瘤內(nèi)GFP+與mCherry+腫瘤細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)Jedi T細(xì)胞殺死了大部分GFP+腫瘤細(xì)胞，但是仍然有一部分GFP+腫瘤細(xì)胞逃脫了T細(xì)胞的殺傷。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)這些逃脫殺傷的GFP+腫瘤細(xì)胞形成了一個細(xì)胞簇，在細(xì)胞簇內(nèi)部T細(xì)胞浸潤水平降低了兩倍。這說明幸存的GFP+腫瘤細(xì)胞簇能夠阻止T細(xì)胞的浸潤，這可能是導(dǎo)致其對免疫治療產(chǎn)生抵抗的原因之一。

Jedi T細(xì)胞攻擊后存活的GFP+腫瘤細(xì)胞聚集成簇

接下來，Agudo教授團(tuán)隊分析了幸存的GFP+腫瘤細(xì)胞與對照mCherry+腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異。他們發(fā)現(xiàn)，與mCherry+腫瘤細(xì)胞相比，GFP+腫瘤細(xì)胞中與細(xì)胞周期相關(guān)的基因明顯下調(diào)。EdU（胸腺嘧啶核苷類似物5-乙炔-20-脫氧尿苷）摻入實驗表明這些在Jedi T細(xì)胞攻擊后存活的GFP+腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期停滯狀態(tài)（稱為靜息腫瘤細(xì)胞，QCCs）。

那么這些QCCs是否對T細(xì)胞的殺傷更具抗性呢？研究團(tuán)隊向腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)入tdTomato-p27K，這可以使QCCs被tdTomato標(biāo)記。向荷瘤小鼠轉(zhuǎn)輸PD-1-/- Jedi T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，相比于對照非免疫原性miRFP670+腫瘤細(xì)胞，存活下來的GFP+腫瘤細(xì)胞大部分都是tdTomato+的，這說明QCCs對T細(xì)胞的殺傷具有更強(qiáng)的抵抗能力。

在Jedi T細(xì)胞攻擊中存活下來的GFP+腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期靜息狀態(tài)，并對T細(xì)胞的殺傷具有更強(qiáng)的抵抗力

以上的結(jié)果表明在小鼠模型中，QCCs是免疫治療耐藥的主力，那這種現(xiàn)象在人類患者中是否也存在呢？通過分析乳腺癌患者組織病理樣本以及轉(zhuǎn)錄組測序，研究院隊發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中與T細(xì)胞接觸的腫瘤細(xì)胞大多是Ki67+的增殖細(xì)胞，p27+的QCCs極少與T細(xì)胞接觸；同時基因集富集分析表明，與治療無應(yīng)答者相比，免疫治療應(yīng)答患者的腫瘤細(xì)胞在DNA復(fù)制相關(guān)通路更加富集，表明它們處于非靜止?fàn)顟B(tài)。這種相關(guān)性提示我們，QCCs可能與乳腺癌患者免疫治療效果不佳有關(guān)。

乳腺癌患者腫瘤組織中靜息腫瘤細(xì)胞周圍T細(xì)胞浸潤較少，并且對免疫治療有應(yīng)答的患者其腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期活躍狀態(tài)

為了探究QCCs的耐藥機(jī)制，研究團(tuán)隊對QCCs以及非靜止腫瘤細(xì)胞進(jìn)行RNA測序。數(shù)據(jù)分析表明，QCCs上調(diào)了缺氧以及葡萄糖代謝相關(guān)通路基因。免疫熒光染色結(jié)果顯示，p27K+QCCs與缺氧探針共定位，而T細(xì)胞則很少浸潤至缺氧區(qū)域；Jedi T細(xì)胞治療后幸存的GFP+腫瘤細(xì)胞也位于低氧區(qū)域中。這些數(shù)據(jù)表明乳腺癌中的QCCs主要位于T細(xì)胞浸潤較少的缺氧微環(huán)境中。

QCCs所在區(qū)域處于明顯的低氧狀態(tài)，并且T細(xì)胞浸潤較少

接下來，為了在單細(xì)胞水平上分析QCCs抑制T細(xì)胞功能的機(jī)制，Agudo教授團(tuán)隊分離了QCCs細(xì)胞簇內(nèi)外的浸潤細(xì)胞，并對其進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部存在大量免疫抑制性成纖維細(xì)胞，這解釋了為何QCCs區(qū)域浸潤T細(xì)胞數(shù)目較少。

對QCCs細(xì)胞簇內(nèi)外浸潤T細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，浸潤在缺氧的QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部的CD8+ T細(xì)胞耗竭程度更深，殺傷能力更弱。

QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部存在大量免疫抑制性成纖維細(xì)胞，浸潤的T細(xì)胞數(shù)量顯著低于QCCs細(xì)胞簇外，并且QCCs細(xì)胞簇內(nèi)浸潤的T細(xì)胞耗竭程度更高

究竟是哪群細(xì)胞促進(jìn)了T細(xì)胞的功能失調(diào)呢？通過對QCCs內(nèi)部浸潤各細(xì)胞亞群進(jìn)行缺氧特征評分，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞表達(dá)豐富的缺氧相關(guān)基因，并且下調(diào)促進(jìn)T細(xì)胞活化的基因，如MHCⅠ與MHCⅡ、IL-12、CD80/86，表明這些DC細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞活化的能力極大地減弱了，這可能是QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部浸潤的T細(xì)胞功能失調(diào)的重要原因。

但是Agudo教授團(tuán)隊通過缺氧誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧并不能直接削弱DC細(xì)胞活化T細(xì)胞的能力，所以研究團(tuán)隊將目光轉(zhuǎn)向QCCs本身。探究是否是表達(dá)HIF1a的QCCs塑造了免疫抑制性的微環(huán)境，損傷DC細(xì)胞活化T細(xì)胞的能力進(jìn)而抑制了T細(xì)胞免疫應(yīng)答。為此，他們構(gòu)建了表達(dá)活化型HIF1a(HIF1aSTBL)的乳腺癌細(xì)胞系。

荷瘤實驗顯示，相比于WT腫瘤，表達(dá)HIF1aSTBL的腫瘤內(nèi)浸潤的T細(xì)胞數(shù)量更少，耗竭程度更深；瘤內(nèi)DC細(xì)胞上MHCⅡ表達(dá)明顯下調(diào)，這些現(xiàn)象與在QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部觀察到的基本一致。

更進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊將WT或表達(dá)HIF1aSTBL的GFP+腫瘤細(xì)胞與mCherry+腫瘤細(xì)胞混合接種至小鼠皮下。發(fā)現(xiàn)相比于mCherry+: GFP+腫瘤組，接種了mCherry+: GFP+ HIF1aSTBL腫瘤細(xì)胞的小鼠瘤內(nèi)浸潤T細(xì)胞數(shù)量更少，并且T細(xì)胞更難接近GFP+腫瘤細(xì)胞，存活的GFP+腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增加了數(shù)倍，可見HIF1a能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

腫瘤細(xì)胞過表達(dá)HIF1aSTBL后能夠抑制T細(xì)胞的浸潤并逃脫T細(xì)胞的攻擊

綜合以上數(shù)據(jù)可見，QCCs正是通過高表達(dá)HIF1a從而來營造一個免疫抑制性的微環(huán)境，逃脫腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的追殺。那么敲除腫瘤細(xì)胞中的HIF1a是否就能夠促進(jìn)T細(xì)胞對腫瘤的殺傷呢？實驗結(jié)果表明敲除腫瘤細(xì)胞中的HIF1a后，腫瘤內(nèi)浸潤T細(xì)胞數(shù)量顯著增加并且耗竭程度降低，腫瘤體積明顯減小。這提示我們靶向腫瘤內(nèi)HIF1a能夠促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤生長。

敲除腫瘤細(xì)胞中的HIF1a顯著增強(qiáng)了抗腫瘤免疫應(yīng)答

總的來說，這項研究揭示了腫瘤抗原陽性的癌細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制：它們聚集成團(tuán)，召喚成纖維細(xì)胞為它們筑起屏障；一起進(jìn)入靜息狀態(tài)并高表達(dá)HIF1a，使得免疫系統(tǒng)的哨兵——DC細(xì)胞功能失調(diào)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些努力使得它們得以逃脫T細(xì)胞的追殺，并在免疫治療后卷土重來。