培養(yǎng)基的配制

植物組織培養(yǎng)中常用的一種培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基的配制包括以下步驟。

培養(yǎng)基母液的配制和保存 MS培養(yǎng)基含有近30種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對這幾十種成分進(jìn)行稱量，可將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL），加水稀釋，制成培養(yǎng)液?，F(xiàn)將制備培養(yǎng)基母液所需的各類物質(zhì)的量列出，供配制時使用。

大量元素（母液Ⅰ） mg/L

NH4NO3 33 000

KNO3 38 000

CaCl2·2H2O 8 800

MgSO4·7H2O 7 400

KH2PO4 3 400

微量元素（母液Ⅱ）

KI 166

H3BO3 1 240

MnSO4·4H2O 4 460

ZnSO4·7H2O 1 720

Na2MoO4·2H2O 50

CuSO4·5H2O 5

CoCl2·6H2O 5

鐵鹽（母液Ⅲ）

FeSO4·7H2O 5 560

Na2-EDTA·2H2O 7 460

有機(jī)成分（母液Ⅳ）

ⅣA

肌醇 20 000

ⅣB

100

鹽酸吡哆醇（維生素B6） 100

鹽酸硫胺素（維生素B1） 100

400

以上各種營養(yǎng)成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液。

上述幾種母液都要單獨(dú)配成1 L的貯備液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸餾水*溶解，然后再將它們混溶，zui后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙?，然后將兩種溶液混合，并將pH調(diào)至5.5，zui后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標(biāo)簽，注明母液號、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

MS培養(yǎng)基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6 芐基嘌呤（6BA）等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且分別配成母液（0.1 mg/mL）。其配制方法是：分別稱取這3種物質(zhì)各10 mg，將2，4-D和NAA用少量（1 mL）無水乙醇預(yù)溶，將6BA用少量（1 mL）的物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，zui后分別定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液。

配制培養(yǎng)液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，與各種母液一起放入燒杯中。

配制培養(yǎng)液時應(yīng)注意：①在使用提前配制的母液時，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制;②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次;③量取母液時，將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯。

溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，zui后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。

需要注意的是，在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。

調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙（5 4～7 0）測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH為5 8為止（培養(yǎng)基的pH必須嚴(yán)格控制在5 8）。

培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。

培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9 cm×9 cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。zui后在錐形瓶外壁貼上標(biāo)簽。

高壓滅菌 培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個步驟。

*，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。

第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用牛皮紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。

第三，滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121.3 ℃下，滅菌20 min。

滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固。放置1 d后再使用。