單克隆抗體（McAb）與各種標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合成為研究細(xì)胞分化抗原、活化抗原和各種受體的重要手段。常用方法有免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞儀（FCM）、犆8免疫組化技術(shù)以及免疫沉淀、SDS-PAGE分析等。125I標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，可以計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞表面平均抗原數(shù)量以及抗原抗體結(jié)合的親和力，是分子免疫學(xué)中一種重要的研究方法。
（一） 原理
125I標(biāo)記的單克隆抗體能與具有相應(yīng)抗原的細(xì)胞結(jié)合，犜Z有數(shù)百倍以上未標(biāo)記的特異性抗體同時(shí)存在的條件下，則標(biāo)記抗體的結(jié)合受到競(jìng)爭(zhēng)性抑制。根據(jù)不同稀釋度抗體分別與相同數(shù)量細(xì)胞結(jié)合后所測(cè)得的特異性計(jì)數(shù)值，可以計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞表面的平均抗原密度以及抗原和抗體的親和力。
（二） 操作步驟
硅化規(guī)格相同的5ml玻璃管，雙蒸水沖凈后烤干，
每次實(shí)驗(yàn)分6～12組，每組5支試管
↓
將１２５I標(biāo)記抗體和非標(biāo)記抗體分別用結(jié)合緩沖液作
倍比稀釋
↓
在同一組5個(gè)試管中每管加入10μl標(biāo)記抗體，4、
5管加入10μl未標(biāo)記抗體（濃度高于同組標(biāo)記抗體
100倍以上），1、2、3管補(bǔ)加10μl結(jié)合緩沖液
↓
洗滌分離或培養(yǎng)的細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)
胞濃度為5×10５～1×10６／80μl，每管中加入
80μl細(xì)胞懸液
↓
輕輕振搖后在4℃條件下（冷室或冰浴上）
孵育30min
↓
將孵育后的細(xì)胞懸液疊加于預(yù)先置小塑料
管內(nèi)的200μl分離液上
↓
臺(tái)式高速離心機(jī)10,000g 2min
↓
切下位于管底細(xì)胞小團(tuán)
↓
γ計(jì)數(shù)
計(jì)算:
1. 特異性計(jì)數(shù)值=總計(jì)數(shù)值（每組1、2、3管平均cpm值）-非特異性計(jì)數(shù)值（每組4、5管平均cpm值）。
2. 結(jié)果用LIGAND和EBDA微機(jī)程序進(jìn)行Scatchad分析，計(jì)算出細(xì)胞表面抗原密度以及抗原與抗體結(jié)合的親和力。
（三） 試劑器材
1. 分離或培養(yǎng)的細(xì)胞
2. 125I標(biāo)記的McAb、未標(biāo)記抗體
3. 結(jié)合緩沖液（binding buffer: RPMI1640, PH7.2，1%BSA，20mM Hepes）
4. 細(xì)胞分離液80% Silicone oil/20% paraffion oil
5. 試管、塑料管、高速臺(tái)式離機(jī)
6. Prosil-28硅化油
（四） 注意事項(xiàng)
1. 每管所需要細(xì)胞數(shù)根據(jù)細(xì)胞種類而定，一般在5×105～1×106/管，若用血小板可用1×108/管。
2. 所用McAb要求純度好、活性高。用氯胺-T法標(biāo)記抗體時(shí)，氯胺-T作用時(shí)間不要超過30秒，比活性以3～6μci/μg McAb為宜，標(biāo)記率在50～70%，犚T保持125I標(biāo)記后McAb的結(jié)合活性。
3. 細(xì)胞、抗體等計(jì)數(shù)、取樣要。
4. 孵育時(shí)間和溫度視競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)所用細(xì)胞和抗體的不同有所差別，可在室溫或37℃條件下進(jìn)行，孵育時(shí)間30min～4h不等。
5. 在整個(gè)操作過程中防止未標(biāo)記抗體對(duì)只加標(biāo)記抗體管的污染，否則會(huì)使整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。
