通常，可溶性蛋白可通過離心、鹽析、電泳和層析來分離。本文介紹可溶性蛋白離子交換柱層析操作規(guī)程：包括了裝柱、柱的平衡與上樣、洗雜蛋白、解離目的蛋白以及柱的清洗與保存操作規(guī)范。

1.裝柱：

1.1 取出層析柱，用去離子水沖洗干凈，連接好管子后固定柱子;

1.2用水沖洗層析柱3-5次，每次10ml去離子水;

1.3取出填料，靜止至室溫后，根據(jù)需要用移液器取出3-5ml的填料進行裝柱，

1.4用去離子水沖洗填料5個柱體積;

2.柱的平衡與上樣：

2.1用0.02M TB bufferA 緩沖液（PH7.6）平衡Ni柱，直至流出液的pH為7.6;

2.2對處理的樣品進行過濾后，緩慢上樣讓蛋白充分結(jié)合;

3洗雜蛋白：

3.1用0.02M TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，清洗沒有結(jié)合到層析柱上的雜蛋白，至流出液與緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

（具體的洗脫梯度需根據(jù)實驗自行調(diào)整）

4解離目的蛋白：

4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液（PH7.6）過柱，共洗約30ml，至流出液與含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;

（具體的洗脫梯度需根據(jù)實驗自行調(diào)整）

5.柱的清洗與保存：

5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA緩沖液（PH7.6）以沖洗層析柱，共沖洗30ml;

5.2用濃度為1.5M的NaCl溶液沖洗層析柱，共沖洗30ml;

5.3用過濾去離子水沖洗50ml;

5.4用20%乙醇沖洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

可溶性蛋白是植物生理實驗例如植物抗寒性、植物抗逆性的重要指標。離子交換柱層析是分離可溶性蛋白的方法之一，本文提供該實驗的一般操作流程，具體的參數(shù)如洗脫度還需根據(jù)實際的實驗情況作自行的調(diào)節(jié)。