1、取對數(shù)生細(xì)胞一個T75或T25瓶。
2、將培養(yǎng)基換成10ml Dmem(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培養(yǎng)基,處理1~2小時。
3、將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉,馬上加入3~4ml 0.1%,并立即搖晃0.5~1min。當(dāng)在顯微鏡下看到分裂相細(xì)胞脫壁后,馬上加入終止液終止消化,并將分裂相細(xì)胞收集在一個15ml的離心管中,并在1200r/min離心4min。
4、將上清液倒掉,剩余50ul左右的液在管中,并輕微震動,使細(xì)胞沉淀重新懸浮。
5、加入10ml的低滲液(0.075M KCL),*毫升要逐滴加入,并邊加邊搖晃。
6、37℃水浴中低滲30min。
7、再加入1ml冰冷的固定液(甲醇:乙酸=3:1 的混合液),并馬上搖勻,離心,1000r/min、10min。
8、同步驟4。
9、加入10ml冰冷的固定液,*毫升要逐滴加入,邊加邊搖晃。
10、室溫下固定30min,然后離心,1000r/min、10min。
11、同步驟4。
12、加入10ml冰冷的固定液,*毫升要逐滴加入,邊加邊搖晃。
13、室溫下固定15min,然后離心,1000r/min、10min。
14、重復(fù)步驟11~13一次。
15、將離心后的上清液倒掉,并加入50~100ul的新鮮固定液重懸細(xì)胞。
16、滴片(玻片要求是濕冷的干凈的,滴片高度要大于30cm。玻片傾斜角度15~30度左右)
17、鏡檢。