ELISA是一種免疫測定。免疫測定(immunoassay，IA)是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。

1.1　抗原

抗原是能在機體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖M(jìn)入機體后，可刺激機體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)。小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機體產(chǎn)生特異性抗體的，稱為半抗原(hapten)。例如某些激素、藥物等。抗原的反應(yīng)性取決于抗原決定簇(antigenic determinant)，或稱為表位(epitope)。一個抗原分子可帶有不同的決定簇。

1.2　抗體

1.2.1　抗體的結(jié)構(gòu)

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈(L)和兩個重鏈(H)的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤模?kappa;(kappa)和λ(Lambda)兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ(gamma)鏈和μ(mu)鏈。IgG的結(jié)構(gòu)見圖。

① 木瓜酶裂解部位 ② 裂解部位→

IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab)。每個Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG*

的抗原性。

IgG可被分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F(ab’)2，能和兩個相同的抗原結(jié)合;另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。

IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。 　機體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可存在，在疾病*后可持續(xù)數(shù)年之久。

IgM抗體一般為保護(hù)性抗體，具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。

1.2.2 　抗體的產(chǎn)生

機體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清(antiserum)。每一系B細(xì)胞只產(chǎn)生針對某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原注入機體，則將由多系的B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的多種抗體，這些抗體均存在于免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或馬制得。產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞可在體外與繁殖力強的腫瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞。將單個雜交瘤細(xì)胞分離，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)而分泌的抗體單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb或Mab)。單克隆抗體僅針對一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細(xì)胞(含產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞)與小鼠腫瘤細(xì)胞融合，分離雜交瘤細(xì)胞，接種于小鼠腹腔，產(chǎn)生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。

1.3　抗原抗體反應(yīng)

1.3.1　可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab。.抗體的親和力(affinity)是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab]。Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果。

1.3.2　zui適比例 在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物(沉淀)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例zui合適的范圍，稱為等價帶(zone of equivalence)。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon)?？贵w過量稱為前帶(prezone)，抗原地過量稱為后帶(postzone)。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。

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1.3.3　特異性 抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg)，雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物(例如血清)中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

但是這種特異性也不是的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜(hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷(敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG)的實際中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。

1.3.4　敏感性 在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。

1.4　免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用

由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定：

1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。

3) 抗生素和藥物。

4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。

5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs等。

1.5. 標(biāo)記的免疫測定

如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，zui后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體(Ab※)檢測抗原(Ag)為例，反應(yīng)式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※。在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)行。

1.6. 酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay)可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous)兩種類型。在均相EIA中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年zui初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay)，簡稱ELISA，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗或酶標(biāo)，已習(xí)用。