1 Taqdna聚合酶

在早期進(jìn)行的pcr反應(yīng)中，使用的是大腸桿菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌體T4 DNA聚合酶。這兩種酶的共同弱點(diǎn)是對(duì)熱不穩(wěn)定性，DNA合成反應(yīng)只能在370C進(jìn)行。PCR時(shí)每一循環(huán)的解鏈溫度都在90C以上進(jìn)行，故在每?jī)蓚€(gè)循環(huán)之間要加入新的DNA聚合酶，使得整過(guò)程整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程很繁瑣和昂貴。同時(shí)在370C，引物與DNA模板之間會(huì)發(fā)生分子非特異性結(jié)合，zui終導(dǎo)致很多非特異性DNA段的擴(kuò)增。

taq 酶有耐高溫的特性，其zui適的活性溫度是720C(75-80)，連續(xù)保溫30分鐘仍具有相當(dāng)?shù)幕钚?，而且在比較寬的溫度范圍內(nèi)都保持著催化DNA合成的能力，一次加酶即可滿足PCR操作過(guò)程自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn)。

(1) TaqDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性及zui適延伸溫度

相對(duì)分子質(zhì)量為94000的TaqDNA聚合酶的酶活性較高，大約為200000Umg，在合成時(shí)有一個(gè)較高的zui適溫度75-80C，轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat接近150nt/(s•酶分子)。這種活性有明顯的溫度依賴性。TaqDNA聚合酶雖然在90C以上合成DNA的能力有限，但高溫時(shí)仍比較穩(wěn)定。有人試驗(yàn)證明在92.5C,95C,和97.5C時(shí)，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經(jīng)130分鐘、40分鐘和5-6分鐘后仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長(zhǎng)。所以，在一個(gè)PCR預(yù)備試驗(yàn)中，每次循環(huán)時(shí)上限溫度為95C(試管內(nèi))處理20秒，則循環(huán)50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實(shí)驗(yàn)的需要。

TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其zui適延伸溫度在75-80C時(shí)，dNTP的摻入速度為35-100nt/(•酶分子),zui長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度7。6kb，如對(duì)M13上的富含GC的30-me引物，該酶在70C的延伸率高于60nt/(•酶分子), 在55C仍有較高的延伸活性，22C和37C時(shí)延伸速度分別為0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可見(jiàn)，在低溫下，TaqDNA聚合酶一表現(xiàn)活性明顯降低，因而，導(dǎo)致此酶在模板鏈分子內(nèi)局部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域的延伸能力受損或前進(jìn)速率常數(shù)與解離常數(shù)的比值發(fā)生改變。在很高的溫度(90C以上)時(shí)，很少DNA合成。在體外條件下，DNA在較高溫度時(shí)的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的限制。溫度對(duì)TaqDNA聚合酶活性的影響見(jiàn)表。

由于TaqDNA聚合酶的zui適延伸溫度高達(dá)75-80C，故退火和延伸反應(yīng)溫度均可提高，限制了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，增加了PCR的特異性。

2 模板

(1) 模板的純度 一般不要求很高，不需要達(dá)到超純。某些擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中甚至可以直接將溶細(xì)胞液煮沸加熱，用蛋白質(zhì)變性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影響擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)存在，例如蛋白酶、核酸酶、結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等;另一類是尿素、十二烷基硫酸鈉、卟啉類物質(zhì)等;還有一類是二價(jià)金屬離子的絡(luò)合劑(如EDTA)等，會(huì)與Mg2+絡(luò)合，影響Taq DNA聚合酶的活性。上述物質(zhì)的存在會(huì)影響擴(kuò)增效果，甚至使擴(kuò)增失敗。

(2) 模板DNA的量 一般對(duì)于單拷貝的哺乳動(dòng)物基因組模板來(lái)說(shuō)，100ul的反應(yīng)體系中有100ng的模板已足夠。有時(shí)，加的模板太多，會(huì)令擴(kuò)增失敗。這時(shí)如果對(duì)模板稀釋后再加入反應(yīng)體系中，往往能獲得成功。

3 dNTP

dNTP儲(chǔ)備液必須為PH7.0左右,濃度一般為2mmol/L, 分裝后置-20C保存.典型的PCR擴(kuò)增體系中,兩種dNTP的終濃度為20-200umol/L. 理論上,100ul反應(yīng)液中兩種dNTP的濃度為20umol/L時(shí),足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA段. DNTP會(huì)絡(luò)合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP會(huì)增加Taq DNA聚合酶的錯(cuò)配率.如果dNTP的濃度達(dá)到1mmol/L時(shí),則會(huì)抑制Taq DNA聚合酶活性.

4 Mg2+濃度

Taq DNA聚合酶在合成新DNA鏈時(shí),要求有游離的Mg2+,因而在PCR系統(tǒng)中確定Mg2+的zui適濃度是必要的. Mg2+濃度太低會(huì)無(wú)PCR產(chǎn)物,太高又會(huì)導(dǎo)致非特異的產(chǎn)物產(chǎn)生. 故常需根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)預(yù)先試驗(yàn),以確定本實(shí)驗(yàn)的*Mg2+濃度,保證DNA聚合酶具有良好的活性.

通常情況下,要求反應(yīng)體系中有0.5-2.5mmol/L的游離Mg2+.反應(yīng)內(nèi)容物中, dNTP能與Mg2+.結(jié)合,所含EDTA會(huì)與Mg2+絡(luò)合,高濃度的DNA也有干擾作用,都會(huì)影響Mg2+的有效濃度.

5 PCR系統(tǒng)中的其它成分

PCR反應(yīng)緩沖溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是兩性離子緩沖劑.此外,還有50 mmol/L KCL, 它有利于引物與模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl對(duì)Taq DNA聚合酶有抵制作用.明膠或血清白蛋白(100ug/ml)及非離子去污劑,如Tween20等,對(duì)Taq DNA聚合酶起穩(wěn)定作用.

6 PCR的熱循環(huán)計(jì)劃

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中,將標(biāo)本加熱至90-95C,使DNA雙鏈變性, 再快速冷卻至40-60C使引物退火并結(jié)合到互補(bǔ)靶序列上,然后升溫至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下?lián)饺雴魏塑账崾挂镅啬０逖由?/span>.每步時(shí)間從反應(yīng)達(dá)到要求溫度后計(jì)算. PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性引物退火和反應(yīng)延伸3個(gè)步驟組成的.圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94C變性1分鐘,60C退火1分鐘,72C延伸1.5分鐘.如此周而復(fù)始,重復(fù)進(jìn)行,直到擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止.

(1) 變性溫度與時(shí)間 使靶基因模板和PCR產(chǎn)物*變性是PCR成敗的關(guān)鍵.DNA在其鏈分解溫度時(shí)的變性只需幾秒鐘,但反應(yīng)管內(nèi)達(dá)到Tss還需一定時(shí)間,變性溫度太高會(huì)影響酶活性;通常情況下94-95C變性1分鐘就足以使模板DNA*變性,更高的溫度可能更為有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低于94C,則需延長(zhǎng)變性時(shí)間.為提高起始模板的變性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先變性7-10分鐘,再按94C的變性溫度進(jìn)入循環(huán)方式,這對(duì)PCR的成功有益處.

(2) 復(fù)性溫度與時(shí)間 復(fù)性溫度決定著PCR的特異性.引物復(fù)性所需的溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和濃度。合適的復(fù)性溫度應(yīng)低于擴(kuò)增引物在PCR條件下真實(shí)Tm值的5C，引物越短(12-15bp),復(fù)性溫度越低(40-45C)。一般來(lái)說(shuō)，若降低復(fù)性溫度(37C)，可提高墳增產(chǎn)量，但引物與模板間錯(cuò)配現(xiàn)象會(huì)增多，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增上升;若提高復(fù)性溫度(56-70C)，雖擴(kuò)增反應(yīng)的特異性增加，但擴(kuò)增效果下降。理想的方法是：設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)，以確定擴(kuò)增反應(yīng)的zui適復(fù)性溫度。

(3)延伸溫度與時(shí)間 Taq DNA聚合酶雖能在較寬的溫度范圍內(nèi)催化DNA的合成，但不合適的溫度仍可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量造成影響。引物延伸溫度一般為72C(較復(fù)性溫度高10C左右)，延伸時(shí)間視目標(biāo)DNA段長(zhǎng)短和濃度而定。在zui適溫度下，核苷酸的摻入率為35-100nt/s，這也取決于緩沖體系、PH值、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)等，延伸1分鐘對(duì)長(zhǎng)達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增帶的出現(xiàn)，但在循環(huán)的zui后一步延伸時(shí)，為使反應(yīng)*，提高產(chǎn)量，可將延伸時(shí)間延長(zhǎng)4-10分鐘。

(4)循環(huán)數(shù) 循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增程度，常規(guī)PCR一般為25-40周期，在其他參數(shù)交已優(yōu)化的條件下，zui適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度，其相應(yīng)關(guān)系參照下表

模板DNA分子數(shù) 需要熱循環(huán)次數(shù)

3.0×105 25-30

1.5×104 30-35

1.0×103 35-40

50 40-45

循環(huán)次數(shù)太少，得不到一定的產(chǎn)物量;循環(huán)次數(shù)太多時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)的后期，產(chǎn)物積累的指數(shù)率下降甚至不再有正確的產(chǎn)物生成，正常的反應(yīng)幾乎停止，呈現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)。

影響出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的因素有：

A、反應(yīng)試劑(dNTP或酶)穩(wěn)定性的改變;

B、終產(chǎn)物(如焦磷酸)的抑制效應(yīng);

C、產(chǎn)物濃度超過(guò)10-5時(shí)可產(chǎn)生重復(fù)退火，于是會(huì)降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性

D、高濃度產(chǎn)物DNA雙鏈的解鏈不寶劍。平臺(tái)效應(yīng)時(shí)的一種重要后果是由于錯(cuò)誤引導(dǎo)，在開(kāi)始時(shí)濃度不高的非特異產(chǎn)物會(huì)繼續(xù)擴(kuò)增，使結(jié)果的分析復(fù)雜化。

7引物的要求：

(1) 一般長(zhǎng)15-30bp，常用20bp(理論上420=11×1011長(zhǎng)的DNA段才會(huì)有重復(fù))。引物過(guò)長(zhǎng)，擴(kuò)增的效率降低。

(2) 堿基組成：C+G占50-60%(常規(guī))，盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤和嘧啶的連續(xù)排列。

(3) 一對(duì)引物之間不能有2個(gè)以上的堿基互補(bǔ)，特別是3‘末端;引物之間的堿基互補(bǔ)會(huì)形成引物二聚體，引物本身應(yīng)避免回文序列。

(4) 引物與模板退火的溫度和所需的時(shí)間取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和溶液中引物的濃度。合適的退火溫度是低于引物本身的實(shí)際變性溫度(Tm)50C。20bp左右長(zhǎng)度的DNA段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火溫度通常在55-720C下進(jìn)行在標(biāo)準(zhǔn)的引物濃度(0.2umol/L)下，幾秒內(nèi)即可完成退火。提高退火溫度可提高引物與模板結(jié)合的特異性。特別在zui初幾次循環(huán)中采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟?，有助?/span>PCR特異性擴(kuò)增。如果引物中(G+C)的含量小于50%，退火溫度應(yīng)低于550C。

(5) 100ul的PCR反應(yīng)液中，引物的量為10-100pmol。PCR反應(yīng)液中2個(gè)引物濃度不等時(shí)，其濃度比為50:1，稱為不對(duì)稱PCR。

簡(jiǎn)并引物：由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。若PCR擴(kuò)增引物的核苷酸組成順序是根據(jù)氨基酸順序推測(cè)而來(lái)，就需合成簡(jiǎn)并引物。

嵌套引物：利用*輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的起始材料，同時(shí)除使用*輪的一對(duì)特異引物外，另加1-2個(gè)新引物(處在同一個(gè)模板DNA的頭兩個(gè)引物之間序列)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。通過(guò)嵌套引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，產(chǎn)生錯(cuò)誤擴(kuò)增的可能性極小，所以應(yīng)用嵌套引物技術(shù)能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴(kuò)增。

PCR的的應(yīng)用：基因克隆、反向PCR、不對(duì)稱PCR、RT-PCR、基因的體外誘變和突變檢測(cè)、基因組的比較研究。