一、人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和成人成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與分化特性的觀(guān)察

目的：觀(guān)察人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和正常成人成骨細(xì)胞分化的特性。方法：在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間，用α-磷酸奈酚法測(cè)定堿性磷酸酶（ALP）活性；放射免疫法測(cè)定骨鈣素（BGP）含量；半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)I型膠原、MMP-1、TIMP-1基因mRNA表達(dá)；Van GieSon氏苦味酸酸性復(fù)紅染色法染色細(xì)胞I型膠原。結(jié)果：人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株接種培養(yǎng)第7天后I型膠原基因表達(dá)較高。MMP-1表達(dá)量隨時(shí)間推移逐漸增加，至第24天達(dá)到高峰。第1~9天TIMP-1 表達(dá)量逐漸增加，其后基本恒定。0~12天ALP活性逐漸增高，致12天達(dá)zui高，其后逐漸下降。18天后，細(xì)胞有許多大小不等的結(jié)節(jié)形成，I型膠原結(jié)節(jié)染色較無(wú)結(jié)節(jié)處深。正常成人成骨細(xì)胞（hOB）接種培養(yǎng)后0~6天細(xì)胞逐漸匯片。0~12天ALP活性逐漸增高，致12天達(dá)zui高，其后逐漸下降。第6天BGP表達(dá)zui高，其后逐漸下降。結(jié)論：分離培養(yǎng)的hOB具有成骨細(xì)胞的特性；人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株為具有人成骨細(xì)胞表型特征的成骨細(xì)胞模型。人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和hOB的生長(zhǎng)分為細(xì)胞增殖、骨基質(zhì)成熟、骨基質(zhì)礦化階段，且I型膠原、BGP、MMP-1、TIMP-1基因表達(dá)及ALP活性呈時(shí)間特異性。

二、人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和成人成骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的表達(dá)

目的：觀(guān)察人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和正常成人成骨細(xì)胞（hOB）基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）表達(dá)的類(lèi)型。方法：MMPs和TIMPs mRNA表達(dá)用RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果：人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和hOB均表達(dá)MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3。人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株可表達(dá)MMP-12，hOB則無(wú)。結(jié)論：人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和hOB表達(dá)的MMPs和TIMPs類(lèi)型基本相似，人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株可以作為具有人成骨細(xì)胞表型特征的成骨細(xì)胞模型來(lái)研究MMPs和TIMPs的表達(dá)與調(diào)控。

三、雌二醇對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和成人成骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的作用

目的：探討雌二醇（17β-estradiol，E2）對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和正常成人成骨細(xì)胞（hOB）基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制因子（TIMPs）的作用和雌激素缺乏致骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制。方法：MMPs和TIMPs蛋白質(zhì)表達(dá)用ELISA和Western Blot檢測(cè)， mRNA用RT-PCR檢測(cè)。MMPs活性用明膠酶譜法檢測(cè)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)E2抑制人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株MMP-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，并且呈劑量依賴(lài)關(guān)系；10-8M E2抑制hOB MMP-1蛋白質(zhì)表達(dá)；E2對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株MMP-2及TIMP-1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)無(wú)影響；E2對(duì)hOB MMP-2及TIMP-1 蛋白質(zhì)表達(dá)無(wú)影響；E2對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和hOB MMP-2活性亦無(wú)影響。結(jié)論：雌激素不足可導(dǎo)致其對(duì)人成骨樣細(xì)胞MMP-1的抑制作用減弱，促進(jìn)骨吸收和骨基質(zhì)分解，此可能為雌激素缺乏致骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病機(jī)制。

四、雌二醇對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和成人成骨細(xì)胞膜型 基質(zhì)金屬蛋白酶-1的影響

目的：膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane type 1-matrix metalloproteinase, MT1-MMP）是zui近發(fā)現(xiàn)的一種可由多種細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶。為探討雌二醇（E2）對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株和正常成人成骨細(xì)胞（hOB）膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（MT1-MMP）的作用和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（OP）的作用機(jī)制。方法  Northern雜交、Western雜交和激光共聚焦顯微系統(tǒng)免疫熒光法分別檢測(cè)MT1-MMP mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。MMP-2活性用明膠酶譜和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)。結(jié)果  觀(guān)察到E2促進(jìn)MG-63細(xì)胞MT1-MMPmRNA表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。E2促進(jìn)MG-63細(xì)胞MT1-MMP蛋白質(zhì)表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系；E2干預(yù)24~48小時(shí)促進(jìn)MG-63細(xì)胞MT1-MMP蛋白質(zhì)表達(dá)；激光共聚焦顯微系統(tǒng)免疫熒光法證實(shí)E2促進(jìn)MT1-MMP蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，MT1-MMP蛋白質(zhì)表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。E2對(duì)MG-63細(xì)胞MMP-2活性無(wú)影響。結(jié)論  E2可促進(jìn)MG-63細(xì)胞MT1-MMP表達(dá)。雌激素不足可減少成骨樣細(xì)胞MT1-MMP表達(dá)，此可能為絕經(jīng)后OP的骨吸收增強(qiáng)機(jī)理之一。