一、動物免疫

動物體內的b淋巴細胞在特定外來抗原的刺激下，可以大量增殖變成漿細胞以分泌針對于該抗原的抗體。脾內不同的B淋巴細胞克隆可分泌針對不同抗原的抗體。當受到特定外來抗原刺激時，相應的B淋巴細胞克隆便大量增殖以分泌相應的特異性抗體。動物免疫的作用就是用特定外來抗原對動物進行一次或多次免疫，以刺激能分泌針對于該抗原抗體的B淋巴細胞大量增殖，從而得到大量產生專一的B淋巴細胞。

二、細胞融合

B淋巴細胞受外來抗原刺激后可以分泌抗體，但它在體外存活很短時間(zui多兩周)后即死亡；而骨髓瘤細胞不分泌任何免疫球蛋白，卻能在體外存活。如果能將這兩種細胞的特性結合起來，我們就能得到既能分泌抗體又能在體外存活的細胞。

脾臟是動物體內B淋巴細胞集中的zui大免疫器官, 取出脾細胞(B淋巴細胞)和骨髓瘤細胞融合后，能產生五種細胞類型；未融合的脾細胞和骨髓瘤細胞, 自身融合的脾細胞和骨髓瘤細胞，以及脾細胞和骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞。其中雜交瘤才是我們需要的，因此就要設法將此雜交瘤細胞從上述細胞混合液中挑選出來。

三、雜交瘤細胞的篩選

在細胞融合后，要從上述五種細胞中篩選出雜交瘤細胞，一般使用HAT培養(yǎng)進行篩選，HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細胞的DNA合成有內源性途徑(主要途徑)和外源性途徑(旁路途徑)兩種方式。內源性途徑就是利用或單磷酸尿苷酸在二氫還原酶的催化下來合成DNA；而外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下來補救合成DNA，HAT培養(yǎng)基中氯基喋呤是二氫還原酶的抑制劑, 能有效地阻斷DNA合成的內源性途徑。B淋巴細胞具有HGPRTTK這兩種酶, 因此在內源性途徑被阻斷后仍能利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶來合成DNA，可在HAT培養(yǎng)基中存活, 但B淋巴細胞是正常細胞, 故不能存活。雜交瘤技術中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞為HGPRT-的TK-缺陷型, 缺乏HGPRT酶和TK酶在內源性途徑被阻斷后不能進行DNA的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。雜交瘤細胞由于繼承了B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，能夠合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT養(yǎng)基中能存活。因此將融合后的混合細胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，只有雜交瘤細胞能存活下來，成為制造單克隆抗體的細胞源。

實 驗 用 品

一、器材

1. 主要設備: 無菌室一間(或超凈臺一臺), 普通離心機一臺, 倒置顯微鏡一架, 酶聯(lián)免疫檢測儀一臺, CO2恒溫培養(yǎng)箱一臺, 恒溫水浴一臺, 高壓滅菌名鍋一個。

2. 小型器材: 二塊, 25ml和50ml培養(yǎng)瓶20個, 96孔和24孔培養(yǎng)板各10塊, 40孔酶標板20塊, 50ml塑料離心管6支, 10ml玻璃離心管10支, 1ml、5ml和10ml吸管各4支, 6cm培養(yǎng)皿2套, 100ml和50ml培養(yǎng)液瓶各10個, 1ml、5ml和10ml注射器各2支, 小滴管8支, 玻璃套管4, 中、小型刀各2把, 中、小型手術鑷各2把, 6號針頭8個, L型6號針頭2個, 500ml和1000ml杯各2個, 酒精燈一盞, 不銹鋼網(55cm 200目)2塊, 解剖盤2個, 培養(yǎng)液抽濾滅菌裝置一套, 橡皮塞若干, 70%酒精棉若干。

二、材料

8~12周齡BALB/c純系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞；滅活人輪狀病毒(用作抗原)。

三、試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基, 小牛血清(FCS), GKN液, 50%PEG液, HT培養(yǎng)液, HAT培養(yǎng)液, 0.5% 臺盼藍(trypan blue), 1 mol/L NaOH, 1 mol/L HCl, 包被液, 底物反應液, 辣根過氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG, , 。