引物設(shè)計原則：

1。長度 一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即taq酶的zui適溫度

2。堿基分布的均衡性 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個

GC含量一般40-60%

GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性

GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。

3。引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。

計算：

對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算

對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“zui近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件zui常用的計算方式。

Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15

4。引物二級結(jié)構(gòu) 引物二聚體

盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響dna聚合酶的延伸。

5。引物3’端 引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴增*失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端zui后一個堿基不與密碼子第三個堿基配對。

6。引物5’端 引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。

5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列(酶切位點5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護堿基)。

5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。

5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)(如、)。

6。引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 過去認(rèn)為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端為G或C。

現(xiàn)在的觀點認(rèn)為，引物的5’端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對的情況下為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的，如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個堿基與模板互補結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。

7。引物的保守性與特異性 保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別

特異性：避免非特異性擴增