解剖、觀察和分析歷來是生物學(xué)研究的基本手段。用于細(xì)胞解剖觀察的主要工具就是顯微鏡，它是我們觀察細(xì)胞形態(tài)zui常用的工具。但其分辨率的zui小數(shù)值不會小于0.2mm（紫外光顯微鏡的分辨率也只能達(dá)到0.1mm）, 這一數(shù)值是光學(xué)顯微鏡分辨率的極限。限制顯微鏡分辨率的關(guān)鍵因素是光的波長（光的衍射效應(yīng)），顯微鏡無論制作得如何精密都無法突破這一極限, 一般顯微鏡設(shè)計的zui大放大倍數(shù)為1000~1500倍, 因為將0.2mm的質(zhì)點放大到0.2~0.3mm（人肉眼的分辨率）就可以辨認(rèn)清楚。如果分辨率不再提高, 只提高放大倍數(shù)毫無意義，并不能增加圖像的清晰度。

在光學(xué)顯微鏡下小于0.2mm的一些細(xì)微結(jié)構(gòu)，即便是再提高放大倍數(shù)也無法看清，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structure）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopic structure; ultrastructure）要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。于是，德國柏林大學(xué)的E. Ruska等便選擇了電子束為光源來突破光學(xué)顯微鏡分辨率的極限，終于在1938年研制出了世界上*臺實用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM）。目前所使用的顯微鏡, 根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡（簡稱光鏡）和電子顯微鏡（簡稱電鏡）兩大類。前者以可見光（紫外光顯微鏡以紫外光）為光源, 后者則以電子束為光源。電鏡的問世，為細(xì)胞生物學(xué)的研究打開了局面。尤其是1953年瑞典學(xué)者成功制造出的超薄切片機以及隨后相繼出現(xiàn)的各種電子染色技術(shù)，使超薄切片技術(shù)得到快速發(fā)展和完善，從而大大推動了電鏡在生物學(xué)研究領(lǐng)域中的廣泛使用。

目前，電鏡技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中已由細(xì)胞水平發(fā)展到了分子和原子水平。英國學(xué)者A. Klug博士已將高分辨電鏡技術(shù)應(yīng)用到了生物大分子的結(jié)構(gòu)測定上，在核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)研究中做出了突出成就，在1982年他也因此獲得了諾貝爾化學(xué)獎?，F(xiàn)在，電鏡已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等*的重要研究手段之一，仍然將為細(xì)胞生物學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域的研究做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

實 驗 目 的

1. 通過對透射電鏡的結(jié)構(gòu)和成像原理的講解, 了解透射電鏡的工作原理和結(jié)構(gòu)。

2. 通過對電鏡演示，了解電鏡的操作方法及其在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用情況。

實 驗 用 品

透射與掃描電鏡、超薄切片機、幻燈機、投影儀、超薄切片示教片，以及各種細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)照片等。

實 驗 原 理

一、電鏡與光鏡的對比

1. 電鏡出現(xiàn)的必然性

普通光鏡雖然仍是我們觀察細(xì)胞形態(tài)zui常用的工具，但由于其所用光源為可見光（或紫外光），故其分辨率（Resolution）存在有一個無法突破的限制。分辨率是指顯微鏡能將近鄰的兩個質(zhì)點分辨清楚的能力, 通常是用相鄰兩點間的距離（D）來表示B其公式如下：

分辨率的數(shù)值越小，顯微鏡的分辨能力就越大，反之越小。由上述公式可以看出，分辨率的數(shù)值與波長成正比，與鏡口率成反比。因此, 要想得到高分辨率必須要縮短波長和加大鏡口率，在普通光鏡中我們使用的光源為可見光，波長為400~700nm （平均值為550nm）, 這個數(shù)值無法改變, *可改變的數(shù)值為鏡口率（N.A.）, N.A.的大小決定于鏡口角的大小和物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)折射率（refraction coefficient）的大小。

由此可見，鏡口率與n及sin a/2成正比。制作鏡頭所用的光學(xué)玻璃的折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃越理想。空氣的折射率為1，水為1.33，香柏油為1.515，a-溴萘為1.66。鏡口角總是小于180°, 所以sin a/2的zui大值必然小于1。對于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣, 鏡口率一般為0.05~0.95; 而油鏡用香柏油為介質(zhì), 鏡口率可接近1.5, 如果用溴萘則可達(dá)1.66。而就目前看來, 光鏡鏡口率的zui大值也只有1.78。根據(jù)計算，光鏡分辨率的zui小數(shù)值不會小于0.2mm（將1.6代入分辨率公式求得）, 約等于光波的一半，紫外光顯微鏡的分辨率也只能達(dá)到0.1mm, 這一數(shù)值是光學(xué)分辨率的極限。限制光鏡分辨率的關(guān)鍵因素是光的波長（光的衍射效應(yīng)）, 光鏡無論制作得如何精密都無法突破這一極限, 所以一般光鏡設(shè)計的zui大放大倍數(shù)為1,000~1,500′, 因為將0.2mm的質(zhì)點放大到0.2~0.3mm（人肉眼的分辨率）就可以辨認(rèn)清楚。

但在一般想象中, 似乎顯微鏡的放大倍數(shù)越大, 觀察到的物體應(yīng)該越清楚。然而事實并不然，因為在這里涉及到有效放大和無效放大兩個概念。有效放大是指本來用肉眼看不清楚的物體經(jīng)顯微鏡放大成像后可以分辨清楚的放大; 而無效放大則是指本來用肉眼能看清楚的物體經(jīng)放大鏡、幻燈機或投影儀等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。此外, 我們所看到的物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，而且還要受到一些物理因素和透鏡質(zhì)量的影響（例如球差和色差等）, 但歸根到底, 影響顯微鏡成像清晰度zui關(guān)鍵的因素是顯微鏡的分辨率。如果分辨率不再提高，只提高放大倍數(shù)毫無意義, 并不能增加圖像的清晰度。

在光鏡下即便是再提高放大倍數(shù)也無法看清亞顯微結(jié)構(gòu)（或超微結(jié)構(gòu)）。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多（表1）, 電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。于是，德國柏林大學(xué)的E.Ruska等便選擇了電子束為光源來突破光學(xué)顯微鏡分辨率的極限，終于在1938年發(fā)明了世界上*臺實用透射電鏡。由此可見，電鏡的問世是研究細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的必然需要。

2. 電鏡與光鏡的異同點

電鏡在結(jié)構(gòu)上與光鏡相同，均是由照明光源和透鏡構(gòu)成。所不同的是，（1）電鏡所用照明光源為電子槍發(fā)射的高壓電子束，而光鏡為鹵燈（或汞燈）產(chǎn)生的可見光（或紫外光）。（2）電鏡所用透鏡為電透鏡，聚焦方式為電聚焦; 而光鏡所用透鏡為光學(xué)透鏡, 聚焦方式為機械聚焦。（3）電鏡所用介質(zhì)必須是真空，而光鏡則為空氣（詳細(xì)區(qū)別見表2）。

電鏡與光鏡的成像原理也基本相同，但由于二者所用照明光源的不同，其成像機理又有著本質(zhì)的區(qū)別。光鏡的成像過程是對可見光的反射與吸收; 而電鏡的成像過程則是通過對電子束的散射。

二、透射電鏡的結(jié)構(gòu)與成像原理

1. 透射電鏡的結(jié)構(gòu)

電鏡的基本構(gòu)造見圖2。在結(jié)構(gòu)上電鏡主要由真空系統(tǒng)、供電及保護(hù)系統(tǒng)、電子照明系統(tǒng)、成象系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)五大部分構(gòu)成，其中, 電子照明系統(tǒng)、成象系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)又被稱為透鏡系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)。

（1） 真空系統(tǒng) 電鏡所用“光”源為高壓電子束，這就要求其介質(zhì)必須處于真空狀態(tài)。一般說來，抽真空的意義有三: ①防止燈絲的氧化損傷;②確保電子束在運行過程中不受空氣分子的干擾（因為電子在運行過程中一旦遇到空氣分子便被散射或吸收, 會嚴(yán)重干擾電子的運動軌跡）; ③去除空氣分子對樣品的污染。

表1 各種光與電子束的波長比較
名 稱 波長 （nm）
可見光 760~390
紫外光 390~13
X-射線 13~0.05
g-射線 1~0.005
電子束  
100V 0.123
10,000V 0.0122
100,000V 0.00387
 
表2 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的異同點
  光學(xué)顯微鏡 電子顯微鏡
照 射 光 光 束 電子束
波長（nm） 長：200~750 短：0.003~0.008
介 質(zhì) 空 氣 真 空
透 鏡 光學(xué)透鏡 電磁透鏡
分 辨 力 0.2~0.1mm 0.1nm
放大倍數(shù) 1,000 1,000,000
聚焦方式 機械聚焦 電聚焦
反 襯 度 吸收、反射 散射、吸收、衍射、相位

真空系統(tǒng)由機械泵、油擴散泵、真空管道、閥門、冷阱和儲氣罐等裝置構(gòu)成。機械泵可從大氣狀態(tài)（1 Pa）抽到1.3′10-5~10-6Pa; 油擴散泵可從1.3′10-6Pa抽到1.3′10-7 ~10-9Pa;冷阱中加入液氮后還可以從1.3′10-9Pa抽到1.3′10-10Pa。對于一般的電鏡，真空度達(dá)到1.3′10-9Pa便可安全使用。但對于高分辨率的超高壓電鏡，真空度必需達(dá)到1.3′10-12Pa才能安全使用，這就要求除上述抽真空裝置外, 還必須使用離子泵和真空渦流泵等來大大提高真空度。

（2） 供電及保護(hù)系統(tǒng) 一般的電鏡均擁有兩個電源, 一個是高電壓低電流的高壓電源，主要作用是產(chǎn)生高速電子;另一個是低電壓高電流的透鏡電源，主要作用是控制高速電子束的運動軌跡。另外, 為了保證電壓和電流的高度穩(wěn)定, 電鏡還配備有高精度的穩(wěn)壓和穩(wěn)流等保護(hù)與控制系統(tǒng); 而且一旦電鏡的某一部分發(fā)生故障后, 電鏡的保護(hù)系統(tǒng)會讓其自動緊急關(guān)機和斷電, 以免損傷電鏡。

（3） 電子照明系統(tǒng) 由電子槍和兩級聚光鏡組成, 電子槍可產(chǎn)生高壓電子束，在燈絲前還有一柵板, 柵板有一孔經(jīng)可調(diào)的小孔，用來控制電子束流的粗細(xì), 以阻擋一些散射電子。極細(xì)的高壓電子束還要經(jīng)過兩級聚光鏡進(jìn)行會聚。*聚光鏡將電子束的直徑縮小20~60倍，第二聚光鏡再將電子束的直徑擴大1~2倍，以期得到極細(xì)而均勻的電子束流。

（4） 成象系統(tǒng) 成象系統(tǒng)包括樣品室、成像和放大裝置。樣品室為放置樣品的部位，樣品放置在一金屬樣品托中（可同時放置兩個不同的樣品），直接插入到樣品室中。此外，還有一冷阱直接與樣品室相連。冷阱由一液氮罐和一金屬導(dǎo)桿組成，金屬導(dǎo)桿直接插入到樣品室中。液氮罐中的液氮（-196℃）將低溫經(jīng)金屬導(dǎo)桿直接傳遞到樣品室中, 低溫金屬導(dǎo)桿通過直接吸附樣品室中的少量空氣分子以提高真空度，而且樣品室內(nèi)溫度的降低還可防止電子的熱漂移。

成像和放大部分分別由物鏡、中間鏡I、中間鏡II和投影鏡四級電磁透鏡組成, 透過樣品的電子經(jīng)過物鏡后可被放大50倍，經(jīng)中間鏡I可被放大3倍, 經(jīng)中間鏡II可被放大15倍，經(jīng)投影鏡可被放大200倍，共計可被放大約500,000倍。

（5） 觀察記錄系統(tǒng) 由觀察室、放大鏡和照相裝置構(gòu)成。觀察室又包括熒光屏和鉛玻璃窗。透過樣品的電子打到熒光屏上可顯示出反映樣品真實結(jié)構(gòu)的圖像。由于電子對人眼有害，故需要通過一個鉛玻璃窗來觀察，為了觀察得更加清晰，在觀察室外還配有一放大鏡。鑒于電子形成的熒光圖像衰減速度很快，所以一旦觀察到理想的結(jié)構(gòu)圖像就需要盡快利用照相裝置進(jìn)行照相。值得注意的是，電鏡照相與普通照相不同，圖像的反襯度zui低時才是正聚焦，且底片還必須要經(jīng)過預(yù)干燥處理。

2. 透鏡電鏡的成像原理

透射電鏡之所以能獲得高分辨率的圖像, 主要是因為它解決了兩個關(guān)鍵問題, 一是用電子槍發(fā)射出了波長極短的電子波, 二是利用電磁透鏡可控制電子的運動軌跡, 即可對電子束進(jìn)行聚焦、放大和成像。故透射電鏡的有效放大倍數(shù)可高達(dá)數(shù)百萬倍。

電子槍發(fā)射出的高速電子束在磁場中聚焦，從而被會聚到待觀察的樣品上;電子束在通過樣品時會發(fā)生散射，但由于樣品不同部位的質(zhì)量厚度不同, 即物質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)不同，電子束發(fā)生散射的程度就不同;透過樣品后的電子束撞擊到熒光屏上，由電能轉(zhuǎn)變成光能，形成了濃淡不同的圖像。此圖像各處濃淡的不同真實反映了樣品不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，因而可用來分析和研究樣品的超微結(jié)構(gòu)。

由此可見，在透射電鏡中，被觀察粒子的大小一定要大于電子束的波長才能被分辨出來, 否則，電子束就會發(fā)生繞射，無法看到粒子。這也是電鏡的分辨率由電子束波長所決定的原因之所在。

另外，用于透射電鏡的標(biāo)本須制成厚度僅有0.05mm的超薄切片，而且由于電子束不能透過玻璃, 因此這種切片需要用用特制的樣品托，而不能用普通光鏡所用的載玻片。

三、電鏡的分類

由于不同種類的電鏡在結(jié)構(gòu)和使用方法上或多或少都有一定程度的交叉或重疊, 因此要試圖把所有各種各樣的電鏡進(jìn)行*合理的分類是十分困難的, 但就目前來講, 根據(jù)電子束和樣品之間作用方式的不同對電鏡進(jìn)行分類是相對比較合理的一種方法, 總的看來，電子束和樣品之間的作用方式有如下四種: 1） 物體透射電子;2） 物體發(fā)射電子;3） 物體反射電子;4）物體吸收電子。常用的電鏡可分為透射電鏡和掃描電鏡兩大類。透射電鏡便屬于物體透射電子的一種類型，應(yīng)用非常廣泛，既可以用來分析生物組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，又可以用來研究金屬內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu); 是當(dāng)今世界上所用電鏡中數(shù)量zui多的一類, 約占現(xiàn)有電鏡總數(shù)的90%左右, 掃描電鏡屬于物體發(fā)射電子這一類, 可以用來觀察復(fù)雜的表面圖像, 其焦深和分辨率不但比光鏡高出很多，而且還能顯示出樣品表面的立體形象。其它兩種作用方式的電鏡由于與我們細(xì)胞生物學(xué)研究關(guān)系不大, 在此就不再一一向大家介紹了。

四、電鏡的操作演示與示教

1. 電鏡操作的演示

學(xué)生參觀分兩組交叉進(jìn)行，一組參觀透射電鏡，一組參觀掃描電鏡，然后再交換參觀內(nèi)容。

2. 電鏡照片的展示

挑選一批具有代表性的動植物細(xì)胞不同超微結(jié)構(gòu)的電鏡照片，供同學(xué)們觀察和學(xué)習(xí)，以了解各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)特征。

作 業(yè)

1. 通過本實驗的學(xué)習(xí)，比較光鏡與電鏡工作原理的區(qū)別。

2. 區(qū)分細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和顯微結(jié)構(gòu), 寫出各種示教細(xì)胞器的名稱及其結(jié)構(gòu)特征。

思 考 題

1. 通過本實驗的學(xué)習(xí)，比較光鏡與電鏡的主要異同點。

答： 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的主要異同點

2. 總結(jié)掃描電鏡與透射電鏡的主要異同點。

答：常用的電鏡可分為透射電鏡和掃描電鏡兩大類。透射電鏡便屬于物體透射電子的一種類型，應(yīng)用非常廣泛，既可以用來分析生物組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，又可以用來研究金屬內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu); 是當(dāng)今世界上所用電鏡中數(shù)量zui多的一類, 約占現(xiàn)有電鏡總數(shù)的90%左右, 掃描電鏡屬于物體發(fā)射電子這一類, 可以用來觀察復(fù)雜的表面圖像, 其焦深和分辨率不但比光鏡高出很多，而且還能顯示出樣品表面的立體形象。

[ 附 ] 掃描電鏡的結(jié)構(gòu)與成像原理

在Oatley等學(xué)者的努力下，于1965年研制成功了世界上*臺實用掃描電鏡（scanning electron microscope, SEM）商品。其功能是用來觀察標(biāo)本的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。它將標(biāo)本表面上發(fā)射出的次級電子，由帶樣電荷的柵極收集后, 即向電子顯象管發(fā)送信號，在熒光屏上顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本表面的真實結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本要進(jìn)行特殊處理。標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒, 重金屬在電子束的轟擊下會發(fā)出次級電子信號, 可用于電子成像。

1. 掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)

掃描電鏡在結(jié)構(gòu)上主要是由電子槍、電磁透鏡、掃描線圈、樣品室、信號的收集、處理及顯示系統(tǒng)，以及真空系統(tǒng)和供電保護(hù)系統(tǒng)等部分組成。其中, 電子槍、電磁透鏡、掃描線圈又被稱為電子光學(xué)系統(tǒng)。

其電子槍所發(fā)射電子的波長一般為1~10nm，使用的電壓范圍為1~10KV。掃描線圈為掃描電鏡所*的結(jié)構(gòu)，可作光柵狀掃描，以便在熒光屏上顯示出掃描圖像。掃描電鏡的樣品室較大，樣品有的樣品托，可在樣品室內(nèi)進(jìn)行各不同方向的平移和傾轉(zhuǎn);另外，在樣品室內(nèi)還裝配有檢測部件。信號的收集、處理及顯示系統(tǒng)包括次級電子探測器、光電倍增管和顯象管。次級電子探測器又由閃爍體和光導(dǎo)管構(gòu)成，主要作用是收集由標(biāo)本表面發(fā)射出的次級電子，并將其轉(zhuǎn)變成光子;光電倍增管可將光子信號放大后，又將其轉(zhuǎn)換成電壓信號;而顯象管便便可將所接受到的電壓信號轉(zhuǎn)變成為亮度不同的圖像。

2. 掃描電鏡的成像原理

電子槍發(fā)射出的電子束，經(jīng)電磁透鏡會聚成極細(xì)的電子束，并進(jìn)而聚焦在待測樣品表面;由于樣品各不同部位的表面形貌不同，入射電子束與樣品表面所噴涂的重金屬原子相互作用后所產(chǎn)生的次級電子信號也不同; 此次級電子信號為探測器接受后, 被轉(zhuǎn)變成光子，傳遞給光電倍增管進(jìn)行放大和轉(zhuǎn)換;轉(zhuǎn)換成的電壓信號經(jīng)掃描線圈掃描后顯示在顯象管的熒光屏上。

由于掃描線圈在樣品上作掃描光柵狀的逐點掃描，再加上顯象管的偏轉(zhuǎn)線圈電流與掃描線圈電流高度同步，因此，顯象管熒光屏上的任何一點的亮度與樣品表面上相應(yīng)點所發(fā)出的次級電子數(shù)均是一一對應(yīng)的，因此，顯示在熒光屏上的圖像就是樣品表面形貌的真實寫照。

綜上所述，掃描電鏡在結(jié)構(gòu)和工作原理上均不同于透射電鏡。如（1）掃描電鏡所用樣品的制備方法簡便, 不需經(jīng)過超薄切片，經(jīng)固定、干燥和噴金后即可;（2）掃描電鏡采用的是次級電子成像; （3）掃描電鏡所觀察到圖像景深長, 圖像富有立體感, 但只能反映出樣品的表面形貌; （4）圖像的放大倍率在很大范圍內(nèi)是連續(xù)可變的（101~105×）;（5）樣品的輻射損傷及污染程度小等。但與透射電鏡相比，掃描電鏡又存在有其不可逾越的局限性，如（1）分辨率還不夠高; （2）無法顯示樣品內(nèi)部的詳細(xì)結(jié)構(gòu)等。為此，近年來出現(xiàn)了一種新的電鏡技術(shù)-冰凍蝕刻技術(shù)（freeze etching），利用“復(fù)膜（replica）”在透射電鏡下進(jìn)行觀察, 既可觀察到樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu), 又可觀察到富有立體感的圖像, 還提高了分辨率。