PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟: (1) 變性(DeNature):目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì);(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍(圖4),這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。

一、 pcr反應(yīng)中的主要成份

1. 引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：(1) 引物長(zhǎng)度約為16-30bp， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長(zhǎng)則比較浪費(fèi),且難以合成。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。(4) 引物3'端與目的序列閱讀框架中密碼子*或第二位核苷酸對(duì)應(yīng), 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。(5) 在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。(6) 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 (7) 引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記、熒光素等. 通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。(8) 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。 (9) 簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。

一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì), 可計(jì)算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計(jì)算：

X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。

2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0,并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq dna聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。

3. Mg2+：Mg2+濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對(duì)于一種新的PCR反應(yīng),可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出zui適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中, 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán), 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì),以保證zui適Mg2+ 濃度。

4. 模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個(gè)拷貝,對(duì)于單拷貝基因,這需要0.1μg的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時(shí),用量更少.靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞,一根頭發(fā),一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物.DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。

5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長(zhǎng)時(shí)間.Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率,一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100μl PCR反應(yīng)中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加,過少則使產(chǎn)量降低.反應(yīng)結(jié)束后,如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

6. 反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+ . Tris·Cl在20℃時(shí)pH為8.3-8.8,但在實(shí)際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA段有利.各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。

二、PCR反應(yīng)參數(shù)

1. 變性：在*輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA*解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不*,往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃?的DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可*,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系*達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。?duì)于富含GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。

2. 退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成，引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高,長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板*配對(duì)時(shí), 應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時(shí)間為37℃-55℃,1-2min。

3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于Taq DNA聚合酶的zui適反應(yīng)溫度75℃.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開始,因?yàn)?/span>Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長(zhǎng)的DNA。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對(duì)很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。

4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后, 反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴(kuò)增, 可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增, 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后, 擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010 。

擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C=C0 (1+P)n 。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA量, P為增效率, n為循環(huán)次數(shù)。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。