2.1.1 概念及原理：
濁點(diǎn)萃取法(cloud point extraction，CPE)〔1〕是近年來出現(xiàn)的一種新興的液—液萃取技術(shù)，它不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，不影響環(huán)境。它以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離。目前該法已成功地應(yīng)用于金屬螯合物、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中[2-5]。
CPE 法除了利用增溶作用外，還利用了表面活性劑另一個重要性質(zhì)——濁點(diǎn)現(xiàn)象。溶液靜置一段時間(或離心)后會形成兩個透明的液相：一為表面活性劑相(約占總體積的5%)；另一為水相(膠束濃度等于CMC)。外界條件(如溫度)向相反方向變化，兩相便消失，再次成為均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物質(zhì)如膜蛋白，與表面活性劑的疏水基團(tuán)結(jié)合，被萃取進(jìn)表面活性劑相，親水性物質(zhì)留在水相，這種利用濁點(diǎn)現(xiàn)象使樣品中疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離的萃取方法就是濁點(diǎn)萃取。圖1顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現(xiàn)象。溫度的改變，引起水化層的破壞，增強(qiáng)了表面活性劑的疏水性。
2.1.2 蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用：
CPE 法可用于分離膜蛋白、酶、動物、植物和細(xì)菌的受體，還可以替代一些分離方法如硫酸銨分級法作為純化蛋白的*步，與色譜方法聯(lián)用。另外，CPE 法分離純化蛋白質(zhì)已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模操作。Minuth等人成功地進(jìn)行了氧化酶濁點(diǎn)萃取的中試研究。雖然使用離心分離器可以使CPE大規(guī)模連續(xù)進(jìn)行，但商品離心分離器用于CPE 的效率和容量仍需進(jìn)一步研究。而且，他們發(fā)現(xiàn)相分離操作受細(xì)胞培養(yǎng)時產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)影響較大，體系兩相間密度差較小，表面張力較小，含產(chǎn)物的表面活性劑相的流變學(xué)行為較復(fù)雜，操作較難。表1列出了CPE法近幾年來在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用。
(1)CPE法用于分離純化膜蛋白
膜蛋白(內(nèi)嵌膜蛋白、外圍膜蛋白)硫水性強(qiáng)、難溶于水，抽提內(nèi)嵌膜蛋白時，既要削弱它與膜脂的硫水性結(jié)合，又耍使它保持硫水基在外的天然狀態(tài)，較難分離純化。由于表面活性刑具有兩親性，它一直作為腹蛋白理想的增溶劑。增溶時，膜蛋白琉水部分嵌入膠束的硫水核中而與膜脫離，又保持了膜蛋白表面的廢水結(jié)構(gòu)。相分離后，膜蛋白與表面活性劑共同析出，與親水性蛋白質(zhì)分離。所以，CPE 法在分離純化膜蛋白方面極有優(yōu)勢。
(2)與其它分析技術(shù)的聯(lián)用
CPE 可以作為液相色譜(HPLC)、流動注射分析(FIA)、毛細(xì)管電泳(CE)等儀器分析的樣品前處理方法，提高檢出靈敏度。表面活性別可以防止樣品吸附在玻璃容器上，易于與FIA中的載液及HPLC中的有機(jī)流動相或膠束流動相混合，可以直接進(jìn)樣。但是在很多應(yīng)用中需要除去表面活性劑后再與儀器聯(lián)用。將萃取物與表面活性劑分離的方法很多。對于CMC＞1mM 的表面活性劑如兩性離子表面活性劑可用透析法，但操作時間較長(24h左右)。對于CMC 較小的表面活性劑可通過色譜柱分離除去，如凝膠柱、毛紉管柱等，分離出的表面活性劑可以再利用，也可以作焚燒處理。但CPE作為HPLC 的樣品前處理方法有兩個缺點(diǎn)：*，常用的表面活性劑在UV區(qū)域有很強(qiáng)的背景吸收。第二，操作時間較長，從色譜柱上需用幾個小時洗脫表面活性劑。表面活性劑的洗脫可能會干擾分析物的測定[3]。
2.2 置換色譜法：
2.2.1 概念及分離機(jī)理：
置換色譜(displacement chromatography)〔6〕作為一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力*的置換劑(displacer)通人色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動下沿色譜柱前進(jìn)，使樣品中各組分按作用力強(qiáng)弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，并在置換劑的推動下流出色譜柱[7]。置換色譜的分離行為與樣品組分和置換劑在實(shí)驗(yàn)條件下的吸附等濕線有直接的。置換色譜要求樣品組分及置換劑的吸附等濕線應(yīng)為Langmuir 型，而且置換劑相對于被分離的各組分應(yīng)有zui強(qiáng)的吸附能力，其吸附等溫線位于所有組分的吸附等溫線的上方[7]，見圖1(A)。根據(jù)物料平衡方程，置換劑在柱中的移動速度uD有下列關(guān)系：
式中uD 為流動相的線速，ф為相比，qD 和cD 分別為置換劑在固定相和流動相中的濃度，qD/cD 是直線OD的斜率，稱之為操作線(operating line)。當(dāng)操作線的斜率小于被分離組分等溫線的起始斜率，樣品才能進(jìn)行置換展開，zui終形成如圖l(中的置換序列，這是在理想的情況下(假定無軸向擴(kuò)散及二次化學(xué)平衡)獲得的置換色譜圖。每一組分形成矩形的平臺(Plateau)洗脫峰，相鄰各組分的平臺洗脫峰組成了一個臺階
狀的色譜圖。此時，樣品中不同的組分以置換劑的速度前進(jìn)，即達(dá)到等速狀態(tài)(isobathic conditions)：
uD＝u2； u3＝u4
式中u2、u3、u4 指被置換的三組分的速度
