平端連接

通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效 率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3"末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為 3"突出一個(gè)堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR 產(chǎn)物的效率通過較高，。在采用大量T4dna連接酶并配以5—10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19 的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M 子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3"末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法 克隆PCR產(chǎn)物。

粘端連接

引物中設(shè)計(jì)入限制酶位點(diǎn)：由于PCR引物的5"末端可以增加一些非 互補(bǔ)堿基，因此可以在兩引物的5"末端設(shè)計(jì)單限制酶或雙限制酶切 位點(diǎn)。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互 補(bǔ)粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計(jì) 不同酶切位點(diǎn)時(shí)，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是需要加長 PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5"端多合成3—4個(gè)堿基 以利于限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切 效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變 PCR方法可克服上述缺點(diǎn)。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至 數(shù)個(gè)核苷酸創(chuàng)造出一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。鑒于PCR引物的3"末端序 列的互補(bǔ)性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中部或近5"端改變1個(gè)或 幾個(gè)堿基對PCR擴(kuò)增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的 長度，而且酶切效果優(yōu)于5"加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方 法較為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。但對于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5"加端法 更為適宜。

T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端

如PCR兩引物的5"末端是A或T，則可在 其5"端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP 存在的情況下，用T4dna聚合酶進(jìn)行處理，則T4DNA聚合酶因具有3"→ 5"外切酶活性而消去3"末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端（圖1）。 此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進(jìn)行連接。這種方法只需 在PCR引物的5"端加2—4個(gè)堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3"末端加一個(gè)堿 基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3"端突出一個(gè) 胸苷的質(zhì)粒dna來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出 100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個(gè)3"末端各加一處胸 苷。因?yàn)樵?種dNTP都存在時(shí)，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅 一種dNTP存在時(shí)，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時(shí)， 用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3"末端突出一個(gè)胸苷的T尾 載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆 PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報(bào)道了另一種制備T－vector的方法。他們 使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在切成平端的載體DNA的3"末端加上一個(gè) 胸苷。由于末端轉(zhuǎn)移酶可以催化多個(gè)堿基（ddTTP）作為底物，使平 端載體DNA分子的兩個(gè)3"末端各加上一個(gè)T。用這種方法制備的T－vector 的不同之處在于前者3"末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5"末端連接，僅 5"末端可與PCR產(chǎn)物的3"末端形成磷酸二脂鍵。

共環(huán)消解法：zui近，Jung等人報(bào)道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化 連接反應(yīng)，使5"端帶有限制酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增DNA片段連接成共環(huán)結(jié) 構(gòu)。然后再用相應(yīng)的限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生粘端DNA片段。對于對稱 性限制酶位點(diǎn)，只需在引蛾的5"末端加上一關(guān)識別序列，因?yàn)樵诖?接成共環(huán)后能恢復(fù)限制酶切位點(diǎn)難于切開的缺點(diǎn)，且可用于雙限制 酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，只不過有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切 點(diǎn)得以恢復(fù)。故此法較適用于單限制酶位點(diǎn)的克隆。