1、引物設(shè)計

細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
1.典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。
3.設(shè)計5"端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
4.避免引物對3"末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
5.避免3"末端富含GC。設(shè)計引物時保證在zui后5個核苷中含有3個A或T。
6.避免3"末端的錯誤配對。3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7.避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5"端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。
有時候，對于引物設(shè)計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3"端使用兼并堿基，因為3"端zui后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

2、引物退火溫度

引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tmzui常用的兩種方法。*個公式來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個公式根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機(jī)程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。