下游應(yīng)用為基因篩選、測(cè)序、突變檢測(cè)和分子診斷等等的用戶,對(duì)PCR保真性要求很高。
降低PCR擴(kuò)增的錯(cuò)誤率可以通過(guò)使用各種具有高保真性的dna聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。
DNA聚合酶的保真度用錯(cuò)誤率來(lái)表示,包括堿基錯(cuò)配率、PCR產(chǎn)物突變百分?jǐn)?shù)等。
在目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中,Pfu酶的出錯(cuò)率zui低,保真度zui高(見(jiàn)附表)。
除對(duì)酶進(jìn)行選擇,研究者也可通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件來(lái)進(jìn)一步減少PCR突變率,包括優(yōu)化緩沖液組成、耐熱聚合酶的濃度及對(duì)PCR循環(huán)條件進(jìn)行優(yōu)化等。
附表: DNA聚合酶的擴(kuò)增錯(cuò)誤率
耐熱DNA聚合酶
堿基錯(cuò)配率
★PCR產(chǎn)物突變百分?jǐn)?shù)(%)
Pfu DNA Polymerase
1.3×10-6
2.6
Taq DNA Polymerase
8.0×10-6
16.0
VentR ® DNA Polymerase
2.8×10-6
5.6
Deep VentR ® DNA Polymerase
2.7×10-6
5.4
Tfl DNA Polymerase
8.3×10-6
16.6
Tbr DNA Polymerase
9.5×10-6
19.0
ΜlTmaTM DNA Polymerase
55.3×10-6
110.6