1. 問(wèn)題：RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物。 
可能原因： 
1）RNA被降解 
建議解決方法： 
在用來(lái)驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA使用良好的無(wú)污染技術(shù)分離RNA； 
在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲(chǔ)存RNA； 
如果使用胎盤(pán)RNase抑制劑，不要加熱超過(guò)45℃或pH超過(guò)8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時(shí)加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 
2）RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑 
建議解決方法： 
通過(guò)乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗?？梢约尤胩窃?.25μg到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)。 
逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。 
將對(duì)照RNA同樣品混合，同對(duì)照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗(yàn)抑制劑。 
3）多糖同RNA共沉淀 
建議解決方法： 
使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 
4）用于合成cDNA*鏈合成的引物沒(méi)有很好退火 
建議解決方法： 
確定退火溫度適合您的引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。 
對(duì)于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機(jī)六聚體. 
確定GSP是反義序列。 
5）起始RNA量不夠 
建議解決方法： 
增加RNA量。 
對(duì)于＜50ng的RNA樣品，可以在*鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 
6）RNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多 
建議解決方法： 
將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火. 
提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對(duì)SuperScriptⅡ可以到50℃，對(duì)ThermoScript可以到65℃。 
注意：不要在＞60℃時(shí)使用oligo(dT)引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。對(duì)于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度≤65℃。 
注意：不要在高于37℃時(shí)使用M-MLV。 
如果不需要全長(zhǎng)cDNA，在*鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物。 
7）引物或模板對(duì)殘余的RNA模板敏感 
建議解決方法： 
在PCR前用RNaseH處理。 
8）靶序列在分析的組織中不表達(dá) 
建議解決方法： 
嘗試其他靶序列或組織 
9）PCR沒(méi)有起作用 
建議解決方法： 
對(duì)兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過(guò)1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物。 

2.問(wèn)題：PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物。 
可能原因： 
1）PCR引物設(shè)計(jì)較差 
建議解決方法： 

避免在引物3"端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計(jì)Tm類(lèi)似的引物。 
2）DNA含有抑制劑 
建議解決方法： 
諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類(lèi)的試劑會(huì)抑制Taq DNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。 
3）富含GC的模板 
建議解決方法： 
對(duì)于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 
4）模板濃度太低 
建議解決方法： 
使用104拷貝的靶序列，以在25到30個(gè)循環(huán)中獲得信號(hào)。 
5）鎂離子濃度太低 
建議解決方法： 
從1mM到3mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的鎂離子濃度。注意：對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。 
6＝退火溫度太高 
建議解決方法： 
使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5℃。因?yàn)檫@些公