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上海士鋒生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測培養(yǎng)基 維生素檢測培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測培養(yǎng)基 化妝品檢測培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測培養(yǎng)基 支原體檢測培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測培養(yǎng)基 弧菌檢測培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測,增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

DNA重組實(shí)驗(yàn)方法

時(shí)間:2016-5-23閱讀:853
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DNA重組是將外源DNA與載體分子連接,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在dna連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中,將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起,而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來,但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
如果是單酶切,為了防止載體本身的自身連接,可以用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理,去掉酶切后5"端的磷酸。這樣做能有效防止質(zhì)粒的自身環(huán)化,降低轉(zhuǎn)化的背景,大大提高重組子的篩出效率。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性,但是在這樣的溫度下,粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16℃,反應(yīng)12-16小時(shí)(過夜),這樣既可zui大限度地發(fā)揮連接酶的活性,又兼顧到粘性末端短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后,還須對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定,挑選出所需的重組質(zhì)粒。


(一)儀器
1.恒溫?fù)u床
2.恒溫水浴
3.恒溫培養(yǎng)
4.小型高速離心機(jī)
(二)材料
1. 氨芐
2. BamHI
3. HindIII
4. T4 DNA連接酶
5. pQE-31 和pUC18-CAT 質(zhì)粒
6. 培養(yǎng)皿
7. 接種針
8. 金屬涂棒
9. 1.5mL 離心管
10.酒精燈
11.鑷子、滅菌牙簽等
(三)試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒(3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit,申

[實(shí)驗(yàn)步驟]
(一)質(zhì)粒DNA
用實(shí)驗(yàn)二提取的pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒。
(二)制備重組DNA
1.在滅菌的1.5mL 離心管中,加入pQE-31質(zhì)粒10mL(2mg/mL),2mL酶切緩沖液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液(各含10個(gè)單位),無菌雙蒸水7mL,至反應(yīng)混合物總體積為20mL,離心混勻,37℃反應(yīng)過夜。
2.在另一無菌1.5mL 離心管中,加pUC18-CAT 質(zhì)粒20mL,加入3mL酶切反應(yīng)液,lmL BamHI和HindIII酶的混合液,無菌雙蒸水補(bǔ)到30mL,37℃反應(yīng)過夜。
3.反應(yīng)完畢后取5mL pQE-31質(zhì)粒的酶切液做電泳分析,檢驗(yàn)酶切是否*。酶切*,進(jìn)行下一步。
4.將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒,分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳(注意加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。電泳結(jié)束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說明書的方法回收DNA片段。前者回收的片段為3.5kb,后者為650bp。
5.將回收的pQE-31載體質(zhì)粒均分為兩份,其中一份與酶切后回收的CAT片段混合,做連接;另一份不加CAT片段,做對(duì)照。操作如下:
在10mL DNA樣品中, 加T4 DNA連接酶緩沖液1mL,T4 DNA連接酶1mL,14℃(室溫)過夜,然后做大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
(三)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
1.用實(shí)驗(yàn)一制備的感受態(tài)細(xì)胞(-20℃保存的)。
2.在100mL的融化后處于冰浴的感受態(tài)細(xì)胞中,加入10mL連接產(chǎn)物,混勻,冰上放置30分鐘,以后的操作參照實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行。同時(shí)做未加CAT片段的空白pQE-31載體質(zhì)粒連接處理后的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的對(duì)照。

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