DNA重組是將外源DNA與載體分子連接,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在dna連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中,將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起,而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來,但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
如果是單酶切,為了防止載體本身的自身連接,可以用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理,去掉酶切后5"端的磷酸。這樣做能有效防止質(zhì)粒的自身環(huán)化,降低轉(zhuǎn)化的背景,大大提高重組子的篩出效率。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性,但是在這樣的溫度下,粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16℃,反應(yīng)12-16小時(shí)(過夜),這樣既可zui大限度地發(fā)揮連接酶的活性,又兼顧到粘性末端短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后,還須對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定,挑選出所需的重組質(zhì)粒。
(一)儀器
1.恒溫?fù)u床
2.恒溫水浴
3.恒溫培養(yǎng)箱
4.小型高速離心機(jī)
(二)材料
1. 氨芐
2. BamHI
3. HindIII
4. T4 DNA連接酶
5. pQE-31 和pUC18-CAT 質(zhì)粒
6. 培養(yǎng)皿
7. 接種針
8. 金屬涂棒
9. 1.5mL 離心管
10.酒精燈
11.鑷子、滅菌牙簽等
(三)試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒(3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit,申
[實(shí)驗(yàn)步驟]
(一)質(zhì)粒DNA
用實(shí)驗(yàn)二提取的pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒。
(二)制備重組DNA
1.在滅菌的1.5mL 離心管中,加入pQE-31質(zhì)粒10mL(2mg/mL),2mL酶切緩沖液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液(各含10個(gè)單位),無菌雙蒸水7mL,至反應(yīng)混合物總體積為20mL,離心混勻,37℃反應(yīng)過夜。
2.在另一無菌1.5mL 離心管中,加pUC18-CAT 質(zhì)粒20mL,加入3mL酶切反應(yīng)液,lmL BamHI和HindIII酶的混合液,無菌雙蒸水補(bǔ)到30mL,37℃反應(yīng)過夜。
3.反應(yīng)完畢后取5mL pQE-31質(zhì)粒的酶切液做電泳分析,檢驗(yàn)酶切是否*。酶切*,進(jìn)行下一步。
4.將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒,分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳(注意加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。電泳結(jié)束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說明書的方法回收DNA片段。前者回收的片段為3.5kb,后者為650bp。
5.將回收的pQE-31載體質(zhì)粒均分為兩份,其中一份與酶切后回收的CAT片段混合,做連接;另一份不加CAT片段,做對(duì)照。操作如下:
在10mL DNA樣品中, 加T4 DNA連接酶緩沖液1mL,T4 DNA連接酶1mL,14℃(室溫)過夜,然后做大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
(三)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
1.用實(shí)驗(yàn)一制備的感受態(tài)細(xì)胞(-20℃保存的)。
2.在100mL的融化后處于冰浴的感受態(tài)細(xì)胞中,加入10mL連接產(chǎn)物,混勻,冰上放置30分鐘,以后的操作參照實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行。同時(shí)做未加CAT片段的空白pQE-31載體質(zhì)粒連接處理后的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的對(duì)照。