DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在dna連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起，而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)，但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。
如果是單酶切，為了防止載體本身的自身連接，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理，去掉酶切后5"端的磷酸。這樣做能有效防止質(zhì)粒的自身環(huán)化，降低轉(zhuǎn)化的背景，大大提高重組子的篩出效率。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性，但是在這樣的溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16℃，反應(yīng)12-16小時(shí)(過(guò)夜)，這樣既可zui大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到粘性末端短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還須對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒。


(一)儀器
1．恒溫?fù)u床
2．恒溫水浴
3．恒溫培養(yǎng)箱
4．小型高速離心機(jī)
(二)材料
1． 氨芐
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA連接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 質(zhì)粒
6． 培養(yǎng)皿
7． 接種針
8． 金屬涂棒
9． 1.5mL 離心管
10．酒精燈
11．鑷子、滅菌牙簽等
(三)試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申

[實(shí)驗(yàn)步驟]
(一)質(zhì)粒DNA
用實(shí)驗(yàn)二提取的pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒。
(二)制備重組DNA
1．在滅菌的1.5mL 離心管中，加入pQE-31質(zhì)粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切緩沖液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10個(gè)單位），無(wú)菌雙蒸水7mL，至反應(yīng)混合物總體積為20mL，離心混勻，37℃反應(yīng)過(guò)夜。
2．在另一無(wú)菌1.5mL 離心管中，加pUC18-CAT 質(zhì)粒20mL，加入3mL酶切反應(yīng)液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)到30mL，37℃反應(yīng)過(guò)夜。
3．反應(yīng)完畢后取5mL pQE-31質(zhì)粒的酶切液做電泳分析，檢驗(yàn)酶切是否*。酶切*，進(jìn)行下一步。
4．將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒，分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳（注意加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)）。電泳結(jié)束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法回收DNA片段。前者回收的片段為3.5kb，后者為650bp。
5．將回收的pQE-31載體質(zhì)粒均分為兩份，其中一份與酶切后回收的CAT片段混合，做連接；另一份不加CAT片段，做對(duì)照。操作如下：
在10mL DNA樣品中, 加T4 DNA連接酶緩沖液1mL，T4 DNA連接酶1mL，14℃（室溫）過(guò)夜，然后做大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
(三)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
1．用實(shí)驗(yàn)一制備的感受態(tài)細(xì)胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后處于冰浴的感受態(tài)細(xì)胞中，加入10mL連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置30分鐘，以后的操作參照實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行。同時(shí)做未加CAT片段的空白pQE-31載體質(zhì)粒連接處理后的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的對(duì)照。