質(zhì)粒是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子，它能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞特定的表型。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進行人工構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比,質(zhì)粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉(zhuǎn)錄外源DNA 序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應(yīng)有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單個酶切位點；（3）能插入較大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb 至10kb 之間，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（簡稱pBS）等。經(jīng)過改造的基因工程質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介，這種基因的運載工具在基因工程中具有極廣泛的用途，而質(zhì)粒的分離與提取則是基因工程zui常用、zui基本的實驗技術(shù)。

一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法和羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株的類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途選擇不同的方法。本實驗介紹zui常用的堿裂解法和煮沸法提取質(zhì)粒DNA。

1. 堿變性法
堿變性法提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性和復(fù)性的差異而達到分離的目的。在pH值高達12.6的堿性環(huán)境中，染色體的線性DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性；共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但兩條互補鏈不會*分離，仍會緊密地結(jié)合在一起。用pH4.8的KAc或NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值到中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此可以迅速復(fù)性；而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已*分開，不能復(fù)性，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀物，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，用酚-氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA，然后用乙醇或異丙醇將溶于上清液中的質(zhì)粒DNA沉淀。

2.煮沸法
細胞用含有TritonX－100的緩沖液處理，溶解細胞膜。用酶解細菌細胞，然后在高溫條件下，使細胞裂解，破壞細菌細胞壁，有助于解開DNA鏈的堿基對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。而閉環(huán)質(zhì)粒DNA配對雖被破壞，但雙鏈彼此不分開，當(dāng)溫度下降時恢復(fù)成超螺旋。變性蛋著染色體DNA一起沉淀下來，質(zhì)粒DNA仍留在上清液中。離心后的上清液再用異丙醇或乙醇處理，沉淀出質(zhì)粒DNA。

以上兩種制備方法的實驗過程中，由于細菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色體DNA容易被切斷成為各種大小不同的碎片而與質(zhì)粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有質(zhì)粒DNA外，還可能有少部分染色體DNA和RNA，必要時可進一步純化。
提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA，但RNA一般并不干擾進一步實驗，如限制性內(nèi)切酶消化，亞克隆及連接反應(yīng)等，因此不必除去。

【試劑與器材】
（一）菌種和培養(yǎng)基
1.大腸桿菌DH5α（含質(zhì)粒pT-GFP，該質(zhì)粒為T載體聯(lián)上了綠色熒光蛋白GFP基因的重組質(zhì)粒）。
2.LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800mL去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.2，加去離子水至總體積1L。分裝于150 mL三角瓶中，每瓶50 mL，置高壓蒸氣鍋以1.034×105Pa，121℃滅菌20分鐘。
3.氨芐(Ampicillin, Amp)母液：用無菌水配成 10 mg/mL水溶液，過濾除菌，分裝成小份存于滅菌有蓋離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?，不宜反?fù)凍溶。

（二）試劑
1.溶液I：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌15min，儲存于4℃冰箱。
2.溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋），1％ SDS（從10% SDS母液中稀釋，SDS母液可室溫保存），現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.溶液III：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，H2O 28.5mL，高壓滅菌，4℃冰箱保存。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
4.3 mol/L 醋酸鈉 (pH5.2)：800 mL水中溶解408.1g NaAc•3H2O，用冰醋酸調(diào)pH至5.2，加水定容至100mL，分裝后高壓滅菌，儲存于4℃冰箱。
5.STE緩沖液：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
6.STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton
X-100。
7.TE緩沖液：10 mmo/L Tris•Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。
8.RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris•Cl(pH7.5)，15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的溶液，于100℃加熱15min，使殘留的DNA酶失活。冷卻后用1.5mL Eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。
9.（10mg/ml）：用10mmol/L Tris.Cl, PH8.0, 新鮮配制。
10.TE飽和酚（1）
11.酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1)：
12.氯仿：異戊醇（24:1）：按氯仿:異戊醇＝24:1體積比加入異戊醇（2）。氯仿可使蛋白變性并有助于水相與有機相的分開，異戊醇則可消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。
13.電泳所用試劑： （1） TBE 緩沖液 (5×)：稱取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20mL，定溶至1000mL。 （2）上樣緩沖液 (6×)：0.25% 溴酚藍，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
14.異丙醇
15.70％乙醇

（二）設(shè)備
超凈工作臺，微量取液器(20μL, 200μL, 1000μL)，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。

【操作方法】
（一）小量制備
堿變性法：
1.將含有質(zhì)粒pGFPuv 的DH5α菌種劃線接種在LB固體培養(yǎng)基（含有100 μg/mL Amp）（3）上，37℃培養(yǎng)12-24小時（4）。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mL LB液體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Amp)中，37℃振蕩培養(yǎng)14~16小時。
2.取1.5 mL培養(yǎng)液加入1.5 mL 離心管中，室溫12, 000 r/min離心1分鐘收集菌體(視菌體量多少，可重復(fù)此步)。
3.加入100 μL預(yù)冷的溶液Ⅰ渦旋振蕩懸浮菌體（5）。
4.加入新配制的溶液Ⅱ200μL，輕緩上下顛倒離心5次，至溶液澄清(千萬不要振蕩)，冰浴5分鐘（6）。
5.立即加入用冰預(yù)冷的150μL溶液III，輕柔振蕩5~10次（7），冰浴5分鐘（8），12, 000 r/min離心5min。
6.取上清移入干凈Eppendorf管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1)，劇烈振蕩20秒。室溫下12,000 r/min離心10分鐘，可見溶液分三層，上層為質(zhì)粒DNA溶液，中層為變性的蛋白層，下層為有機相。
7.取上清（6），加入400μL氯仿:異戊醇(24:1)，劇烈振蕩20秒。12,000r/min 離心10分鐘。（選做）
8.取上清，加入2~2.5倍體積無水乙醇振蕩混勻，沉淀DNA，-20℃放置10min（7）。（或者加1倍異丙醇，室溫靜置10min），12,000rpm 離心10分鐘。
9.去上清，加入200μL 70%乙醇（8），12000g，2分鐘。洗滌沉淀兩次以去鹽。
10.將Eppendorf管倒置于一張紙巾上，使液體流出，然后短暫離心，用移液器小心取出殘液，這一步操作要格外小心，有時沉淀塊貼壁不緊，放離心管于超凈工作臺蒸發(fā)痕跡乙醇。（除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴）。
11.將沉淀溶于30μL TE緩沖液(pH8.0，含20μg /mL RNaseA)中（9），儲于-20℃冰箱中。如直接酶切，可將沉淀溶于30~50μL ddH2O（含20μg /mL RNaseA）。
12.利用比色法測定質(zhì)粒DNA在260 nm和280 nm下的光吸收值并計算樣品濃度。
13.用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒DNA的純度和條帶情況。

煮沸法
1.取1.5ml 培養(yǎng)菌體（1）置于離心管中,10000ｇ離心1分鐘。
2.棄上清（2），將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3.將菌體沉淀懸浮于350ul STET 溶液中, 渦旋混勻。
4.加入25ul 新配制的溶液(10mg/ml) （3）, 渦旋振蕩3 秒鐘混勻。（溶液PH值不能低于8.0，否則就不能有效發(fā)揮作用。）
5.將離心管放入沸水浴中,時間恰為40秒，12000g，離心10分鐘。
6.吸出上清移至另一個離心管，或直接用消毒牙簽取出沉淀物，在上清中加入40ul 5mol/L NaAc（PH5.2）和420ul 異丙醇，振蕩混勻，室溫放置5分鐘。
7.12000g，4℃離心5分鐘，將Eppendorf管倒置于一張紙巾上，使液體流出，然后短暫離心，用移液器小心取出殘液，這一步操作要格外小心，有時沉淀塊貼壁不緊，放離心管于超凈工作臺蒸發(fā)痕跡乙醇或室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（2－5）分鐘。
8.棄上清， 加入1ml70％乙醇，12000g，4℃離心2分鐘。按步驟7回收核酸沉淀。
9.加入50ul TE（PH8.0）（含無DNA酶的RNA酶 20ug/ml），溶解DNA，稍加振蕩，儲存于－20℃。

（二）大量制備
堿變性法：
1.從平板上挑選一個單菌落，接種到50mL培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)14~16小時。
2.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL離心管，4,800r/min 4℃離心10分鐘。
3.沉淀用10mL STE洗滌，渦旋打勻， 4,800r/min 4℃離心10分鐘。
4.加入3mL溶液I，渦旋，冰浴5分鐘。
5.加入6mL溶液Ⅱ(現(xiàn)配)，輕柔顛倒數(shù)次直至溶液澄清，保持冰浴5分鐘。
6.馬上加入溶液Ⅲ 4.5mL，輕柔顛倒5~10次，得到白色沉淀，冰浴3－5分鐘。
7.4,800r/min 4℃離心20分鐘，取上清，加入0.6倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，沉淀DNA。
8.4,800r/min室溫離心 10分鐘，去上清，加入75%乙醇，洗滌沉淀。
9.4,800r/min離心 10分鐘，去上清，吸出痕量剩余乙醇，風(fēng)干。
10.加入1.5mL TE溶液，溶解沉淀，轉(zhuǎn)入7mL離心管。
11.加入等體積5mol/L LiCl (預(yù)冷)，顛倒混勻，冰浴10分鐘，沉淀大分子RNA。
12.10,000r/min 4℃ 離心10分鐘，取上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘。
13.10,000r/min 室溫離心10分鐘，室溫放置20~30分鐘。用700μl含無ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀
14.轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，加入等體積13% PEG8000/1.6mol/L NaCl，混勻，冰浴10分鐘，沉淀雙螺旋質(zhì)粒DNA。
15.12,000r/min離心10分鐘，去上清，加入1mL 75%乙醇，洗滌沉淀。
16.12,000r/min離心10分鐘，去上清，吸出痕量剩余乙醇，風(fēng)干。
17.加入600μL TE溶液溶解沉淀。
18.酚、酚：氯仿：異戊醇、氯仿：異戊醇各抽提一次，去除蛋白。
19.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入1/10體積3M NaAc，2倍體積無水乙醇，4℃沉淀10分鐘。
20.12,000r/min 離心10分鐘，去上清，加入1mL 75%乙醇，洗滌沉淀。
21.12,000r/min 離心10分鐘，去上清，吸出痕量剩余乙醇，風(fēng)干。
22.加入200μL ddH2O，溶解質(zhì)粒。

（三）聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒ＤＮＡ
這里介紹的方法（R.Tresman,個人通訊）已卓有成效地用于純化堿裂解法制備的質(zhì)粒ＤＮＡ。
１）將核酸溶液[上頁步驟22）所得]轉(zhuǎn)入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用Ｓorvall SS34 轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）于４℃下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ。
２）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使zui后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使zui后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
４）用500μl含無ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質(zhì)粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒ＤＮＡ沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于４℃以12 000g離心５分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl處于４℃以12 000g離心２分鐘。
９）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到zui后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用ＴＥ（pH8.0)] 后測量ＯＤ260，計算質(zhì)粒ＤＮＡ的濃度（１ＯＤ260＝50μg質(zhì)粒ＤＮＡ/ml）， 然后將ＤＮＡ貯于－20℃。

【注意事項與提示】
（一）小量制備
1. 堿變性法注意事項
（1）市售酚中含有醌等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉 (作為抗氧化劑)，并用等體積的0.5mol/L Tris•Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris•Cl(pH8.0) 緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配于有機相。
（2）氯仿可使蛋白變性并有助于水相與有機相的分開，異戊醇則可消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。
（3）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力（抗生素），否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失；
（4）使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加），細菌培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致細胞和DNA的降解，培養(yǎng)時間不要超過16小時；
（5）溶液I中各成分的作用：葡萄糖的作用是分散細胞，EDTA是Ca和Mg等二價金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價金屬離子從而達到抑制DNase的活性。
（6）溶液Ⅱ加入后5min內(nèi)快速用溶液III中和，防止共價閉和環(huán)狀質(zhì)粒DNA在強堿環(huán)境中暴露時間過長發(fā)生不可逆的變性，質(zhì)粒易被打斷；溶液II中各成分的作用：NaOH主要是為了溶解細胞，釋放DNA，因為在強堿性的情況下，細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的變化；但NaOH易和空氣中的CO2發(fā)生反應(yīng)形成NaCO3，降低了NaOH的堿性，所以必須用新鮮的NaOH。SDS與NaOH聯(lián)用，其目的是為了增強NaOH的強堿性，同時SDS能很好地結(jié)合蛋白，產(chǎn)生沉淀。
（7）加入溶液II 和III后不要劇烈振蕩，防止可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中；
（8）復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染；
（9）酚:氯仿:異戊醇抽提后，應(yīng)小心吸取含質(zhì)粒DNA的上清溶液，防止吸到位于有機相和水相之間的變性的蛋白質(zhì)，約可吸到420μL；
（10）使用冰乙醇沉淀DNA，并在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀更*。
（11）沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等；
（12）TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性，pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解；
（13）溶液III 中各成分的作用：溶液III 中的KAC是為了使鉀離子置換 SDS 中的納離子而形成了 PDS，因為十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate,PDS），而 PDS 是不溶水的，同時一個 SDS 分子平均結(jié)合兩個氨基酸，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。2 M 的醋酸是為了中和 NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷 DNA，所以要中和。基因組 DNA 一旦發(fā)生斷裂，就不能再被 PDS 共沉淀了，所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然zui后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制Dnase；
得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶即超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。

2. 煮沸法注意事項
（1）從表達內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸步驟不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育時，質(zhì)粒DNA可被降解。 用70％乙醇洗滌一步前增加用酚：氯仿進行抽提步驟，可避免此問題。
（2）的細菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液時，一定要除盡。否則質(zhì)粒DNA不能被限制酶 切割。
（3）添加有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。

（二）聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒ＤＮＡ常見問題及可能原因

1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。
2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。
3.與染色體DNA分離不全：變性過程不*；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。