DNA的重組
(一)DNA的酶切與連接
(1)酶切反應(yīng)
同質(zhì)粒dna的鑒定，只不過(guò)是質(zhì)粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。
(2)加2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。
(3)15000rpm離心15min，棄上清。
(4)加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。
(5)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。
(6)測(cè)定DNA的含量。
(7)加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入dna片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應(yīng)12～16h。
(8)連接反應(yīng)液可置-20℃保存，供轉(zhuǎn)化用。
(9)關(guān)于待插入DNA片段的獲得參見(jiàn)附注。
(二)大腸桿菌感受態(tài)的制備及重組DNA的轉(zhuǎn)化
1.感受態(tài)的制備
(1)接種單菌落于2ml LB培養(yǎng)液中， 37℃過(guò)夜。
(2)取0.25ml過(guò)夜菌入25ml LB培養(yǎng)液中，37℃振搖4～6h至A590=0.4～0.6。
(3)倒入50ml管內(nèi)，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。
(4)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl25ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。
(5)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl21.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2.重組DNA的轉(zhuǎn)化
(1)將3只Eppendorf管按下列轉(zhuǎn)化項(xiàng)目作好標(biāo)記，然后按下述進(jìn)行：
轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 受體菌 DNA 總體積
DNA對(duì)照組 0 10μl 200μl
受體菌對(duì)照組 200μl 0 200μl
轉(zhuǎn)化組 190μl 10μl 200μl
(2)冰浴30min至1h。中間搖動(dòng)3次，以防受體菌沉底。
(3)42℃90s。
(4)37℃水浴5min。
(5)加入無(wú)相應(yīng)抗生素的Lb 200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。
(6)分別取3組反應(yīng)物各50μl在含相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
(三)轉(zhuǎn)化子DNA的快速鑒定-快速細(xì)胞破碎法
(1)挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌接種于含相應(yīng)抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)至A590值為0.6～0.8。
(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。
(3)加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍(lán)1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。
(4)15000rpm離心15min。
(5)吸取上清點(diǎn)樣電泳，觀察。
(四)轉(zhuǎn)化子DNA的酶切鑒定
1.轉(zhuǎn)化子DNA的快速少量抽提
(1)同本節(jié) 二.(三).1.
(2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,離心9min，去上清。
(3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。
(4)15000rpm離心15min。
(5)吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。
(6)15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。
(7)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。
(8)取少量DNA電泳，觀察濃度。
2.轉(zhuǎn)化子DNA的小量酶切鑒定 同質(zhì)粒DNA的小量酶切鑒定，見(jiàn)本節(jié) 一(三)。
(五)重組子DNA的進(jìn)一步鑒定
可用Southern印跡雜交法或斑點(diǎn)雜交法等進(jìn)一步鑒定，詳見(jiàn)本節(jié) 四。
[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段
(1)用合適的酶切割DNA并電泳。
(2)于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內(nèi)，用夾子封好袋口，并檢查有無(wú)漏孔。
(3)將透析袋(縱長(zhǎng))與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內(nèi)電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。
(4)取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內(nèi)液體放入1.5ml的離心管內(nèi)，10000rpm離心5min。
(5)吸出上清放入離心管內(nèi)，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內(nèi)。
(6)加入1/10體積的3mol/L AaAc,2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于-20℃放置4～5h。
(7)于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。
(8)用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。
(9)真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。
