SDS是一種陰離子去垢劑，化學(xué)名十二烷基苯磺酸鈉，由于在高溫條件下能裂解細(xì)胞并與細(xì)胞中多糖結(jié)合而被作為提取物質(zhì)被廣泛使用。SDS法提取主要應(yīng)用于植物dna的提取和質(zhì)粒提取，本文對(duì)這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行講解。

SDS法提取植物基因組DNA

本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的組織細(xì)胞用熱的SDS裂解后，加入高濃度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖類(lèi)雜質(zhì)，zui后用乙醇或異丙醇沉淀。

一、材料試劑和儀器

1 材料 新鮮的組織材料或-80℃凍存的材料

2 試劑

(1)提取緩沖液

Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0)

EDTA 50mmol/L (pH8.0)

NaCl 500 mmol/L

滅菌后加β-巰基乙醇至10 mmol/L

(2)裂解液20%SDS

(3)高鹽溶液5mol/L KAc

(4) RNaseA 10mg/ml

(5) 異丙醇

(6)滅菌ddH2O或TE

3. 儀器: 離心機(jī)， 恒溫水浴, 臺(tái)式高速離心機(jī)，電泳裝置

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到加有500μL提取液的離心管中,輕輕混勻。

2 向管中加入50μL20%SDS溶液，混勻，不可過(guò)于強(qiáng)烈震蕩以防基因組DNA斷裂 ，65℃保溫10min，并不時(shí)搖動(dòng)。

3 加入150μL 5mol/L KAc，混勻，置冰上20-30 min。

4 4℃,15 000rpm離心15min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入0.7V的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30 min 。

5 12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。

6 加入1/10體積的RNaseA，37℃保溫20min，除去RNA。

7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。

8 用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。

9 電泳檢測(cè)完整性。

三、結(jié)果分析

1. 用紫外分光光度計(jì)在230nm、260nm、 280nm和310nm波長(zhǎng)分別讀數(shù)。其中260nm用瓊脂糖凝膠電泳(0.8%)檢測(cè)核DNA的完整性。完整性好的基因組DNA應(yīng)是一條比23Kb滯后的電泳帶, 若降解則成為彌散狀。電泳前緣為未除干凈的RNA。

2.如果DNA沉淀呈白色透明狀而且溶解后成粘稠狀，說(shuō)明DNA含有較多的多糖類(lèi)物質(zhì)，可以在取材前將植物放暗處24hr，以達(dá)到去除淀粉的目的。

3. DNA沉淀呈棕色，難以酶切

植物材料含有大量酚類(lèi)化合物，與DNA共價(jià)結(jié)合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反應(yīng)。為防止此情況出現(xiàn)，可在加入2 ×CTAB的同時(shí)加入2-5%的巰基乙醇，或者加入亞精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亞精胺)。

4.DNA中含有多糖或鹽類(lèi)

將DNA用乙醇或異丙醇沉淀出來(lái)，離心，沉淀用70%乙醇清洗兩次或更多次，吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否則電泳點(diǎn)樣時(shí), 樣品上漂)

5.DNA已降解電泳條帶呈彌散狀

樣品降解可能有兩種情況：一是機(jī)械振動(dòng)過(guò)劇烈，二是操作過(guò)程中DNase污染。在提取DNA的各個(gè)操作過(guò)程中要避免劇烈振蕩，提取液及用品要高溫高壓滅菌。另外，使用Tip頭吸取過(guò)程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，Tip頭應(yīng)剪去Tip頭尖，避免反復(fù)凍融DNA。

SDS裂解法提取大量質(zhì)粒

本法的產(chǎn)量低得多，但卻比其他方法更溫和，是提取大質(zhì)粒(大于15kb)的方法。

試驗(yàn)步驟：

1. 將500ml細(xì)菌沉淀物洗過(guò)后重懸于10ml用冰預(yù)冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，將懸液移至30ml的帶蓋螺口塑料試管中。

2. 加入2ml新配制的溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值小于8.0時(shí)，不能有效地發(fā)揮作用。

3. 加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 將管倒置數(shù)次以混勻懸液，在冰上放置10min。

4. 加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混勻內(nèi)容物，使SDS均勻分散到整個(gè)細(xì)菌懸液中，操作應(yīng)盡可能溫和小心，以便zui大限度地避免釋放出來(lái)的DNA受到剪切。

5. 立即加入6ml 5mol/L NaCl(終濃度為1mol/L)， 再次用玻棒溫和*地混勻內(nèi)容物，在冰上放置至少1h。

6. 以4℃[用Beckman Ti50型轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭)]，30 000rpm離心30min，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml的一次性塑料離心管中，棄去沉淀物。如果細(xì)菌碎片未能全部除盡，可用35 000rpm再離心20min，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，去掉存在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。

8. 將水相轉(zhuǎn)移到250ml的離心瓶中，于室溫加入2倍體積的(約60ml )乙醇，充分混勻，室溫下放置1-2h。

9. 以4℃，5000rpm離心20min，回收核酸。

10. 離心管倒置于紙巾上，使zui后殘存的乙醇流干，在真空干燥內(nèi)短時(shí)間干燥沉淀物，但不要使之*干燥。

11. 用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。

zui后，大家要注意的是，植物基因組DNA提取中，各個(gè)操作步驟都要避免劇烈振蕩，避免反復(fù)凍融DNA。SDS法是提取大于15kb的質(zhì)粒方法，要注意在真空干燥沉淀物時(shí)，不能使其*干燥。