SDS是一種陰離子去垢劑，化學名十二烷基苯磺酸鈉，由于在高溫條件下能裂解細胞并與細胞中多糖結(jié)合而被作為提取物質(zhì)被廣泛使用。SDS法提取主要應用于植物dna的提取和質(zhì)粒提取，本文對這兩個實驗操作步驟進行講解。
SDS法提取植物基因組DNA
本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的組織細胞用熱的SDS裂解后，加入高濃度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖類雜質(zhì)，zui后用乙醇或異丙醇沉淀。
一、材料試劑和儀器
1 材料 新鮮的組織材料或-80℃凍存的材料
2 試劑
(1)提取緩沖液
Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0)
EDTA 50mmol/L (pH8.0)
NaCl 500 mmol/L
滅菌后加β-巰基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高鹽溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 異丙醇
(6)滅菌ddH2O或TE
3. 儀器: 離心機， 恒溫水浴, 臺式高速離心機，電泳裝置
二、實驗步驟
1取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到加有500μL提取液的離心管中,輕輕混勻。
2 向管中加入50μL20%SDS溶液，混勻，不可過于強烈震蕩以防基因組DNA斷裂 ，65℃保溫10min，并不時搖動。
3 加入150μL 5mol/L KAc，混勻，置冰上20-30 min。
4 4℃,15 000rpm離心15min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入0.7V的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。
6 加入1/10體積的RNaseA，37℃保溫20min，除去RNA。
7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。
8 用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 電泳檢測完整性。
三、結(jié)果分析
1. 用紫外分光光度計在230nm、260nm、 280nm和310nm波長分別讀數(shù)。其中260nm用瓊脂糖凝膠電泳(0.8%)檢測核DNA的完整性。完整性好的基因組DNA應是一條比23Kb滯后的電泳帶, 若降解則成為彌散狀。電泳前緣為未除干凈的RNA。
2.如果DNA沉淀呈白色透明狀而且溶解后成粘稠狀，說明DNA含有較多的多糖類物質(zhì)，可以在取材前將植物放暗處24hr，以達到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色，難以酶切
植物材料含有大量酚類化合物，與DNA共價結(jié)合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反應。為防止此情況出現(xiàn)，可在加入2 ×CTAB的同時加入2-5%的巰基乙醇，或者加入亞精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亞精胺)。
4.DNA中含有多糖或鹽類
將DNA用乙醇或異丙醇沉淀出來，離心，沉淀用70%乙醇清洗兩次或更多次，吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否則電泳點樣時, 樣品上漂)
5.DNA已降解電泳條帶呈彌散狀
樣品降解可能有兩種情況：一是機械振動過劇烈，二是操作過程中DNase污染。在提取DNA的各個操作過程中要避免劇烈振蕩，提取液及用品要高溫高壓滅菌。另外，使用Tip頭吸取過程中應避免產(chǎn)生氣泡，Tip頭應剪去Tip頭尖，避免反復凍融DNA。
SDS裂解法提取大量質(zhì)粒
本法的產(chǎn)量低得多，但卻比其他方法更溫和，是提取大質(zhì)粒(大于15kb)的方法。
試驗步驟：
1. 將500ml細菌沉淀物洗過后重懸于10ml用冰預冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，將懸液移至30ml的帶蓋螺口塑料試管中。
2. 加入2ml新配制的溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值小于8.0時，不能有效地發(fā)揮作用。
3. 加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 將管倒置數(shù)次以混勻懸液，在冰上放置10min。
4. 加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混勻內(nèi)容物，使SDS均勻分散到整個細菌懸液中，操作應盡可能溫和小心，以便zui大限度地避免釋放出來的DNA受到剪切。
5. 立即加入6ml 5mol/L NaCl(終濃度為1mol/L)， 再次用玻棒溫和*地混勻內(nèi)容物，在冰上放置至少1h。
6. 以4℃[用Beckman Ti50型轉(zhuǎn)頭(或與其相當?shù)霓D(zhuǎn)頭)]，30 000rpm離心30min，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個50ml的一次性塑料離心管中，棄去沉淀物。如果細菌碎片未能全部除盡，可用35 000rpm再離心20min，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，去掉存在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。
8. 將水相轉(zhuǎn)移到250ml的離心瓶中，于室溫加入2倍體積的(約60ml )乙醇，充分混勻，室溫下放置1-2h。
9. 以4℃，5000rpm離心20min，回收核酸。
10. 離心管倒置于紙巾上，使zui后殘存的乙醇流干，在真空干燥內(nèi)短時間干燥沉淀物，但不要使之*干燥。
11. 用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。
zui后，大家要注意的是，植物基因組DNA提取中，各個操作步驟都要避免劇烈振蕩，避免反復凍融DNA。SDS法是提取大于15kb的質(zhì)粒方法，要注意在真空干燥沉淀物時，不能使其*干燥。
