實驗原理：核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi)，進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉(zhuǎn)導的頻率大約為10-4，這項技術(shù)能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的Dmem培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L

注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細胞50%以上的zui低濃度。

2、操作步驟[方法一]：

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受體細胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉(zhuǎn)染試驗。

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細胞。

(4)轉(zhuǎn)染受體細胞

①將處于對數(shù)生已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉(zhuǎn)染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml(25ml培養(yǎng)瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導轉(zhuǎn)染基因的表達。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進行篩選。同時設有未能轉(zhuǎn)染的對照細胞。

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉(zhuǎn)染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。

⑦2周后對照細胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進行克隆化和擴大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細胞株，并做進一步鑒定。

本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可，其方法如下：

3、基因組DNA轉(zhuǎn)染[方法二]：

(1)配制磷酸轉(zhuǎn)染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?/span>

加溫水至 1000mL

(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。

(3)取供體基因組DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。

(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。

(5)加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結(jié))，置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時，即可用于轉(zhuǎn)染細胞。 (6)取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生細胞，在轉(zhuǎn)染前4小時，更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。

(7)轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時。

(8)培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養(yǎng)2～3周。

(9)檢測：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后，克隆分離，擴大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細胞株。

脂質(zhì)體介導DNA轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。

用LR進行轉(zhuǎn)染時，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：*，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1～5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數(shù)繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間(2～24小時)。因LR對細胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。

細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

1、操作步驟[方法一]：

(1)細胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105個細胞培養(yǎng)液，37℃CO2培養(yǎng)至40%～60%匯合時(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞)。

(2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。

(3)轉(zhuǎn)染準備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時，使其達到50～60%板底面積。

(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復合物方法如下：

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復合物，37℃培養(yǎng)3～5小時。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時，

(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24～48小時。

(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前(2)、(3)步驟。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時。

(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。

DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導進入細胞核，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30分鐘-1.5小時)，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。

方法如下：

(1)接種鼠L成纖維細胞濃度為5×105CO2/孔/皿生長2～3天，當達50%板底面積可用。

(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA。

(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長因子血清的DMEM洗板(皿)。

(4)在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細胞中，使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時。

(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM)。

(6)培養(yǎng)細胞，在適當時間分析細胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，方法同前。