離心是蛋白質(zhì)、酶、核酸及細胞亞組分分離的zui常用的方法之一,也是生化實驗室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經(jīng)成為研究生物大分子實驗室中的常用技術(shù)方法。
離心機(centrifuge)是實施離心技術(shù)的裝置。離心機的種類很多,按照使用目的,可分為兩類,即制備型離心機和分析型離心機。前者主要用于分離生物材料,每次分離樣品的容量比較大,后者則主要用于研究純品大分子物質(zhì),包括某些顆粒體如核蛋白體等物質(zhì)的性質(zhì),每次分析的樣品容量很小,根據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為(可用離心機中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)地監(jiān)測),能推斷其純度、形狀和相對分子質(zhì)量等性質(zhì)。這兩類離心機由于用途不同,故其主要結(jié)構(gòu)也有差異。
離心原理
將樣品放入離心機轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi),離心機驅(qū)動時,樣品液就隨離心管做勻速圓周運動,于是就產(chǎn)生了一個向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同,在同一固定大小的離心場中沉降速度也就不相同,由此便可以得到相互間的分離。
離心力和相對離心力
溶液中的固相顆粒做圓周運動時產(chǎn)生一個向外離心力,其定義為:
F = mω2r
式中:
F 為離心力的強度; m 為沉降顆粒的有效質(zhì)量;
ω 為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動的角速度,其單位為rad/s;
r 為離心半徑(cm),即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。
很顯然,離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大,而隨著離心半徑的減小而降低。目前離心力通常以相對離心力Fcf 表示,即離心力F 的大小相對于地球引力(G)的多少倍,單位為g,其計算公式如下:
Fcf = 1.119×105(h)2r×g
可以看出,在同一轉(zhuǎn)速下,由于f 的不同,F(xiàn)cf相差會很大,實際應(yīng)用時一般取平均值。在離心實驗的報告中,F(xiàn)cf、r 平均、離心時間t 和液相介質(zhì)等條件都應(yīng)表示出來,因為它們都與樣品的沉降速度有直接的。顯然Fcf是一個只與離心機相關(guān)的參數(shù),而與樣品并無直接的關(guān)系。
沉降速度與沉降系數(shù)
一個顆粒要沉降,它必須置換出位于它下方等體積的溶液,這只有當(dāng)顆粒的質(zhì)量大于被置換出的液體的質(zhì)量時才能通過離心的手段達到,否則,在離心過程中顆粒將發(fā)生向上漂浮,而不是下沉。當(dāng)顆粒在運動時,不論方向如何,它都要穿過溶劑分子,所產(chǎn)生的摩擦力總是與顆粒運動的方向相反。
摩擦力的大小與顆粒的運動速度成正比,并且受顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)的影響:
式中:
f 為顆粒在濟劑中的摩擦系數(shù).與顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)相關(guān);
v 為顆粒的沉降速度。
由于離心力的存在,顆粒將加速運動直到摩擦力與離心力相等。在這種情況下,顆粒所受到的凈作用力為零,顆粒將以zui大速度運動。
式中 Mp 和M s 分別為顆粒的質(zhì)量及等體積的溶劑的質(zhì)量。
上式中的Mp 和M s 很難確定,為了建立分子大小與沉降系數(shù)之間的關(guān)系,引入了沉降系數(shù)這一新的概念。沉降系數(shù)定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度,它以svedberg單位計算,1S=1×10-13 s。例如,核糖核酸酶A 的沉降系數(shù)為1.85×10-13 s,即可記作1.85S。
近年來,在生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程等書刊文獻中,對于某些大分子化合物,當(dāng)它們的詳細結(jié)構(gòu)和分子量不很清楚時,常常用沉降系數(shù)這個概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30 s 亞基和50s 亞基,這里的s 就是沉降系數(shù),現(xiàn)在更多地用于生物大分子的分類,特別是核酸