DNA測(cè)序是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)關(guān)鍵性發(fā)現(xiàn)的推動(dòng)力。比如，一個(gè)人基因組的全部序列為醫(yī)學(xué)診斷和醫(yī)療保健提供重要的標(biāo)記物和指導(dǎo)方針。盡管過(guò)去10年已取得眾多進(jìn)步，但是當(dāng)前大多數(shù)高通量測(cè)序儀器都是依賴于光學(xué)技術(shù)來(lái)檢測(cè)DNA的四個(gè)結(jié)構(gòu)單元：A、C、G和T。為了進(jìn)一步提高測(cè)量能力，科學(xué)家們已開發(fā)出電子DNA測(cè)序（electronic DNA sequencing）技術(shù)來(lái)對(duì)一組DNA模板進(jìn)行測(cè)序。zui近，科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)在施加的電流的作用下，DNA能夠穿過(guò)蛋白納米孔（protein nanoscale pore）從而在單分子水平上產(chǎn)生電子信號(hào)。然而，四個(gè)核苷酸堿基在化學(xué)結(jié)構(gòu)上非常相似，利用這種技術(shù)很難將它們區(qū)別開來(lái)。因此，研究和開發(fā)一種單分子電子DNA測(cè)序平臺(tái)是一個(gè)zui為活躍的研究領(lǐng)域，而且有潛力產(chǎn)生一種手持的DNA測(cè)序儀：它能夠破譯基因組從而有助于開展個(gè)人化醫(yī)學(xué)治療和基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究。
來(lái)自美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的一個(gè)研究小組（由哥倫比亞大學(xué)基因組技術(shù)與生物分子工程中心主任、化學(xué)工程與藥物學(xué)教授Jingyue Ju博士）和來(lái)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）的研究人員（由美國(guó)物理學(xué)會(huì)成員John Kasianowicz博士）開發(fā)出一種能夠區(qū)分單個(gè)堿基的新方法來(lái)潛在地在單分子水平上利用納米孔進(jìn)行電子DNA測(cè)序。相關(guān)研究論文于9月21日在線刊登在Scientific Reports期刊上。
在這項(xiàng)研究中，研究人員報(bào)道的這種基于納米孔的邊合成邊測(cè)序（nanopore-based sequencing by synthesis, Nano-SBS）的策略通過(guò)檢測(cè)4種不同大小的標(biāo)記而能夠在單分子水平上準(zhǔn)確地區(qū)分4種DNA堿基，其中這4種標(biāo)記是從用于序列測(cè)定的5’-磷酸修飾的核苷酸（5'-phosphate-modified nucleotide）上釋放出來(lái)的。Nano-SBS策略的基本原理如下所示。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）期間，當(dāng)每個(gè)核苷酸類似物被整合進(jìn)正在延長(zhǎng)的DNA鏈時(shí)，由此形成的磷酸二酯鍵讓它所攜帶的標(biāo)記釋放出來(lái)。這些標(biāo)記物將按照釋放的順序進(jìn)入納米孔，并根據(jù)它們不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生各自*的離子電流阻塞特征（ionic current blockade signature），因而能夠利用電子手段在單分子水平上區(qū)分單個(gè)堿基并確定DNA序列。為了驗(yàn)證這個(gè)原理，研究人員附著4種不同長(zhǎng)度的聚合物標(biāo)記到2’-脫氧腺苷-5’-四磷酸（2'-deoxyguanosine-5'-tetraphosphate, 即前面所述的5’-磷酸修飾的核苷酸，是一種核苷酸類似物）的末端磷酸基團(tuán)上，并證實(shí)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，這些核苷酸類似物能夠被有效地整入到DNA鏈中，而且基于它們各自*的納米孔離子電流阻塞特征能夠更好地在單分子水平上對(duì)這四種標(biāo)記進(jìn)行基準(zhǔn)線區(qū)分。這種方法與附著到以矩陣形式排布的納米孔的聚合酶結(jié)合在一起就應(yīng)當(dāng)能夠構(gòu)建出單分子電子Nano-SBS平臺(tái)。
在之前由Ju教授與Nicholas J. Turro博士的一項(xiàng)研究中， 哥倫比亞大學(xué)基因組技術(shù)與生物分子工程中心利用可裂解的熒光核甘酸可逆性末端終止（cleavable fluorescent nucleotide reversible terminator; nucleotide reversible terminator, NRT）開發(fā)出四色邊合成邊測(cè)序（four-color DNA sequencing by synthesis; sequencing by synthesis, SBS）平臺(tái)。利用可裂解的熒光核甘酸可逆性末端終止（NRT）進(jìn)行邊合成邊測(cè)序（SBS）是一種用于下一代DNA測(cè)序系統(tǒng)中的主導(dǎo)方法。
Kasianowicz博士和他的NIST研究團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)性地研究了用于單分子分析的納米孔。他們之前報(bào)道了不同長(zhǎng)度的聚合物（即聚乙二醇, polyethylene glycol, PEG），能夠通過(guò)它們?cè)趩畏肿铀缴蠈?duì)α-溶血素（α-hemolysin）蛋白納米孔中的電流讀數(shù)的*影響而被區(qū)別開來(lái)?；诖?，他們隨后為當(dāng)前這項(xiàng)研究中的電子DNA測(cè)序方法給出理論上的支撐。將SBS概念與*的納米孔可檢測(cè)的用來(lái)標(biāo)記DNA結(jié)構(gòu)單元的電子標(biāo)簽（electronic tag）結(jié)合起來(lái)就導(dǎo)致研究人員開發(fā)出當(dāng)前這項(xiàng)研究中描述的單分子電子Nano-SBS方法。
正如論文*作者Shiv Kumar博士指出的那樣，“我們的方法新穎之處在于設(shè)計(jì)和使用4種不同標(biāo)記的核苷酸，并且這些不同標(biāo)記的核苷酸一旦被DNA聚合酶整入到DNA鏈上就會(huì)釋放4種不同大小的標(biāo)記，接著當(dāng)這4種標(biāo)記通過(guò)納米孔時(shí)，它們就能夠在單分子水平上被相互區(qū)分開來(lái)。這種方法就克服了DNA四個(gè)堿基之間的小差別所帶來(lái)的任何限制，這些限制也是當(dāng)前大多數(shù)納米孔測(cè)序方法幾十年來(lái)所面臨的挑戰(zhàn)。”再者，這種技術(shù)是相當(dāng)靈活的；利用PEG標(biāo)記作為原型，人們也能夠選擇其他的化學(xué)標(biāo)記來(lái)在不同納米孔系統(tǒng)中提供*的分離。
隨著進(jìn)一步開發(fā)這種Nano-SBS方法，如使用大型蛋白或固態(tài)納米孔矩陣，這種系統(tǒng)有潛力準(zhǔn)確地、快速地和低成本低地對(duì)整個(gè)人類基因組進(jìn)行測(cè)序，從而使得它能夠用于常規(guī)性醫(yī)學(xué)診斷。
原文摘要：
PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis
We describe a novel single molecule nanopore-based sequencing by synthesis （Nano-SBS） strategy that can accuray distinguish four bases by detecting 4 different sized tags released from 5′-phosphate-modified nucleotides. The basic principle is as follows. As each nucleotide is incorporated into the growing DNA strand during the polymerase reaction, its tag is released and enters a nanopore in release order. This produces a unique ionic current blockade signature due to the tag's distinct chemical structure, thereby determining DNA sequence electronically at single molecule level with single base resolution. As proof of principle, we attached four different length PEG-coumarin tags to the terminal phosphate of 2′-deoxyguanosine-5′-tetraphosphate. We demonstrate efficient, accurate incorporation of the nucleotide analogs during the polymerase reaction, and excellent discrimination among the four tags based on nanopore ionic currents. This approach coupled with polymerase attached to the nanopores in an array format should yield a single-molecule electronic Nano-SBS platform.
