本文的主要目的是掌握F-4600熒光分光光度計(jì)的正確的操作方法，確保儀器的正常運(yùn)作。此外也列舉了一些熒光分光光度計(jì)使用中的注意事項(xiàng)。

1.目的：規(guī)范F-4600熒光分光光度計(jì)的使用，保證儀器的正常運(yùn)行。

2.范圍：適用于F-4600熒光分光光度計(jì)

3.職責(zé)：質(zhì)量管理部檢驗(yàn)中心、研發(fā)部化驗(yàn)員負(fù)責(zé)本規(guī)程的執(zhí)行。

質(zhì)量管理部、研發(fā)部負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)本規(guī)程實(shí)施情況的監(jiān)督檢查。

4.內(nèi)容：

4.1 儀器組成

熒光分光光度計(jì)，熒光池，配套系統(tǒng)，計(jì)算機(jī)，打印機(jī)。

4.2原理

某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光較長(zhǎng)的熒光，物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以做該物質(zhì)的定性分析。

4.3操作步驟

4.3.1打開光度計(jì)左側(cè)的電源開關(guān)，儀器前方右側(cè)的運(yùn)行指示燈和氙燈指示燈亮。

4.3.2儀器啟動(dòng)15分鐘后，打開電腦，打開熒光分光光度計(jì)工作站，聯(lián)機(jī)工作。在工作站的右側(cè)出現(xiàn)一個(gè)綠色的顯示為Ready字樣的標(biāo)志，表明電腦與儀器連接良好，可以進(jìn)行下面的工作。在工作站的右側(cè)出現(xiàn)一豎排的指示，點(diǎn)擊“Method”新建一個(gè)測(cè)定方法。如果之前已經(jīng)有設(shè)定完成的，可以直接沿用。

4.3.2.1 在General選項(xiàng)中，Measuarement有四種選擇，分別是①Wavelength scan波長(zhǎng)掃描 ②Time scan時(shí)間掃描 ③photometry 光度值法 ④3-D Scan 三維掃描。使用者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行方法選擇。氯化鈉、氯化鉀的鋁鹽測(cè)量選用的是photometry光度值法。

4.3.2.2在Operator 選項(xiàng)中輸入操作者的名字;Instrument 顯示的是聯(lián)機(jī)儀器的型號(hào);如果實(shí)驗(yàn)需要測(cè)定樣品組、設(shè)定樣品表，則在下面的Coments 空格中進(jìn)行設(shè)定，如果測(cè)定過程中有空白，則不需設(shè)定樣品表，即不選擇 Use sample table,而實(shí)驗(yàn)過程中每一個(gè)樣品均需人工操作。

4.3.2.3Quantitation（定量法）界面中的操作

4.3.2.3.1在Quantitation中可選擇的定量類型有Wavelength（波長(zhǎng)）、Peak area（峰面積）、Peak height（峰高）、Derivative（派生方法）、Ratio（比率）,選擇Wavelength（波長(zhǎng)）。

4.3.2.3.2在Number of 選項(xiàng)中有：1單波長(zhǎng)計(jì)算、2雙波長(zhǎng)計(jì)算、3三波長(zhǎng)計(jì)算的選項(xiàng)，選擇1單波長(zhǎng)計(jì)算。

4.3.2.3.3在Calibration中選擇校準(zhǔn)類型，選項(xiàng)有：None（無關(guān)聯(lián)測(cè)定樣品）、1st order（直線）、2nd order（2次方曲線）、3rd order（3次方

曲線）、Segmented（折線法），選擇1st order直線模式。

選擇None時(shí)，在后面的儀器波長(zhǎng)設(shè)定中zui高可選擇6個(gè)可設(shè)定波長(zhǎng)。而選擇其他選項(xiàng)時(shí)，可設(shè)定3個(gè)波長(zhǎng)。

在Concentration中選擇數(shù)據(jù)單位為%（百分?jǐn)?shù)）。

對(duì)Manual calibrate（手工校準(zhǔn)）、Force curve through zero（強(qiáng)制曲線通過零點(diǎn)）均可不做選擇，又要去時(shí)按照標(biāo)準(zhǔn)操作。

Digit after decimal選項(xiàng)中按要求填寫十進(jìn)制小數(shù)點(diǎn)后的位數(shù)，輸入范圍為0~~3。處設(shè)為0。

下面的Lower concentration 、Upper concentration中設(shè)定濃度的下限與上限。此處設(shè)定為0~~1000。如果被測(cè)濃度高于濃度上限，在Avg Conc 列陣上將出現(xiàn)“H”,如果低于濃度上限，將出現(xiàn)“L”.

4.3.2.4 Instrnment 界面中的操作

4.3.2.4.1Data mode 中有三種數(shù)據(jù)模式：Fluorescence 熒光強(qiáng)度，Luminescence 發(fā)光強(qiáng)度，Phosphorescence 磷光強(qiáng)度。選擇Fluorescence 熒光強(qiáng)度。

4.3.2.4.2在Wavelength中選擇波長(zhǎng)類型：EX WL Fixed 固定的激發(fā)光波長(zhǎng)，EM WL Fixed 固定的發(fā)射光波長(zhǎng)，Both WL Fixed固定的的兩者波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)者根據(jù)要求選擇Both WL Fixed。然后在下面的空格中填入實(shí)驗(yàn)所需要的波長(zhǎng)。

4.3.2.4.3 EX:激發(fā)光夾縫寬度，EM：發(fā)射光夾縫寬度。均選擇5nm.

4.3.2.4.4 PMT Voltage : PMT電壓。用于控制光電倍增管檢測(cè)器的電壓，從400—700V選擇一個(gè)數(shù)值：400V.

4.3.2.4.5 Auto statistic calc :自動(dòng)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)計(jì)算。輸入數(shù)值后設(shè)定

須進(jìn)行計(jì)算的樣品數(shù)，可計(jì)算他們的平均值、SD（標(biāo)準(zhǔn)偏差）、CV（變異系數(shù)）。設(shè)定為2.

4.3.2.4.6 Replicates:設(shè)定重復(fù)測(cè)量的數(shù)目，輸入范圍為1至20.此處設(shè)定為1.

4.3.2.4.7 Integration:積分時(shí)間。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)獲得平均的數(shù)據(jù)值，從而獲得穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。設(shè)定時(shí)間：0.1s。

4.3.2.4.8 Delay: 掃描延遲時(shí)間，輸入范圍為0-9999s，為實(shí)驗(yàn)時(shí)點(diǎn)擊對(duì)話框的確定按鍵后儀器默認(rèn)的延遲掃描時(shí)間，也可以人為的自己控制速度而不需要設(shè)定掃描延遲時(shí)間。

4.3.2.5 在Standards界面中選擇標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)量，在下面的空格中選擇標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)量，并設(shè)定好標(biāo)準(zhǔn)的濃度等。

4.3.2.6 在Monitor 中設(shè)定Y軸的zui大、zui小值。一般zui大值設(shè)定為1000，zui小值為0。同時(shí)選擇 Open data processing window after data acquisition 選項(xiàng)。

4.3.2.7 在Report 界面中，Output 選項(xiàng)中選擇Print Report，同時(shí)將Print items 下面的選型根據(jù)需要進(jìn)行選擇，也可全選。

4.3.3 在設(shè)定完方法后，點(diǎn)擊“確定”，進(jìn)入工作站的測(cè)定界面。按照工作站的要求測(cè)定，前面設(shè)定的方法為None 無關(guān)聯(lián)測(cè)定樣品，首先測(cè)定的是對(duì)照品。點(diǎn)擊右側(cè)的 measure 選項(xiàng)，開始測(cè)定。將空白樣品放入檢測(cè)室后，選擇左下角的Blank（空白樣品）測(cè)定。之后將待測(cè)樣品放入檢測(cè)室，點(diǎn)擊Sample進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定兩遍，自動(dòng)計(jì)算平均值。之后儀器自動(dòng)計(jì)算并生成檢測(cè)報(bào)告。如果某個(gè)樣品測(cè)定值不穩(wěn)定，可以選擇這個(gè)樣品的數(shù)據(jù)后，點(diǎn)擊 Remeasure 重新測(cè)定。

待測(cè)定完成后，點(diǎn)擊 End 按鍵，測(cè)定結(jié)束?？芍苯哟蛴?bào)告。也可在關(guān)閉工作界面時(shí)，將文件保存在固定的文件夾中，方便以后查找數(shù)據(jù)。

4.3.4 測(cè)定完成后，關(guān)閉工作站，會(huì)顯示一個(gè)提示界面，如果下面還有其他樣品需要測(cè)定，可以選擇Close the monitor window , but keep the lamp open , 如果測(cè)定完成，則選擇Close the lamp , then close the monitor window. 這時(shí)熒光燈關(guān)閉，但是儀器內(nèi)的風(fēng)機(jī)繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，在30 min 后，儀器冷卻下來后，關(guān)閉左邊的電源開關(guān)。蓋上防塵罩。填寫儀器使用記錄。

4.4 注意事項(xiàng)

4.4.1 溶劑不純會(huì)帶入較大誤差，應(yīng)先做空白檢查，必要時(shí)應(yīng)用玻璃磨口蒸餾器蒸餾后再用。

4.4.2 溶液中的懸浮物對(duì)光有散射作用，必要時(shí)應(yīng)用垂熔玻璃濾器濾過或用離心法除去。

4.4.3 所用玻璃儀器與熒光池等也必須保持高度潔凈。

4.4.4 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響，測(cè)定時(shí)應(yīng)控制溫度一致。

4.4.5 溶液中的溶氧有降低熒光作用，必要時(shí)可在測(cè)定前通入惰性氣體除氧。

4.4.6 測(cè)定時(shí)需注意溶液PH值和試劑的純度等對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。

小結(jié)：zui后再提醒下大家檢測(cè)時(shí)所使用的比色皿一定要清洗干凈，如果有多個(gè)樣本不同的濃度，建議由低濃度到高濃度樣本你逐個(gè)檢測(cè)，防止清晰不干凈帶來的誤差。