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免疫血清制備方法

免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性*用。免疫血清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，?？色@得價(jià)的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時(shí)，則需同時(shí)加用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時(shí)間間隔等，也是影響免疫血清效價(jià)的重要因素應(yīng)予重視。
 
一、原理
 
具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，表現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。
 
二、免疫方法
 
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說(shuō)明。
 
1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；
 
2.*次免疫：用2ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
 
3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè)窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個(gè)淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí)，直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下。
 
4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5~1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)（即試血）。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時(shí)才能放血。
 
5.若效價(jià)未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外，也可在第2次免疫后，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡(jiǎn)稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立即放血。
 
三、放血
 
（一） 心臟采用血法
 
1.家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；
 
2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；
 
3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)zui強(qiáng)的部位；
 
4.用50ml注射器（連接16號(hào)針頭），傾針45°角度，對(duì)準(zhǔn)心搏zui強(qiáng)處刺入心臟抽血致死；
 
5.將抽取的血液立即注入無(wú)菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
 
（二） 頸動(dòng)脈放血法
 
1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；
 
2.沿頸部中線切開(kāi)皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。?br /> 
3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離；
 
4.于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用*夾住；
 
5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；
 
6.松開(kāi)*，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。
 
四、分離血清
 
將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí)，再置4℃冰箱內(nèi)3~4小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑（0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉，zui終濃度），分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />