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大鼠嗅球成鞘細胞分離培養(yǎng)方法
點擊次數(shù)：300 發(fā)布時間：2012-10-25
大鼠嗅球成鞘細胞分離培養(yǎng)方法
1. 材料與方法
1.1 實驗動物及試劑
出生7-9d大鼠幼仔、手術(shù)器械、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS、0.125%*、PBS等包被：Poly-L-Lysine多聚賴氨酸，儲存液濃度為4mg/ml，超純水稀釋（1:300）。使用時濃度為13.3ug/ml。24孔板每孔加50ul室溫孵育1h后吸去，超純水清洗后吹干。
DMEM培養(yǎng)基10ml，添加劑：*（146.15）2mmol/L0.3mg/ml ，牛胰島素 10ug/ml ，人轉(zhuǎn)鐵蛋白 100ug/ml， 硒（172.94） 0.224umol/L，0.04ug/ml 3,3',5-L-三碘甲狀腺原氨酸（672.96） 0.49umol/L，0.33ug/ml
1.2 實驗方法
1.2.1 脫頸處死大鼠幼仔，固定在手術(shù)板上，用75%乙醇噴灑頭部皮膚消毒
1.2.2 剪去頭部皮膚，然后作環(huán)形切口，除去顱蓋，在鼻尖處顯露腦和兩個嗅球
1.2.3 從腦部輕輕取下嗅球，用PBS清洗2~3遍，除去血塊和毛細血管等
1.2.4 剪碎組織塊,用濃度為0. 125 %的*37 ℃水浴消化15-20 min
1.2.5終止消化后輕輕吹打嗅球組織，過濾后離心（1000 r/ min ,5 min） 去除上清液,重復(fù)1-2次
1.2.6 重懸細胞沉淀，接種到多聚賴氨酸包被過的24孔板種，一只幼仔可接1~2孔，每天換液并觀察培養(yǎng)結(jié)果
2. 實驗結(jié)果
接種后觀察，細胞密度較高，同時血細胞較多；1 h后細胞開始貼壁，呈球形，難以辨認細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。24h后細胞大多貼壁，未出現(xiàn)形態(tài)。兩至三天后細胞形態(tài)穩(wěn)定，生長較好，成纖維細胞較少。
3.討論
接種12 h 后有少量細胞貼壁, 懸浮細胞多見；24 h 后可見貼壁細胞增多，少數(shù)細胞變形, 呈長梭形；2 d 后變形細胞多見, 突起延伸變長；另可見極少數(shù)胞體大而圓、突起較多但較短的細胞， 確定為神經(jīng)元。
1周后,細胞形態(tài)穩(wěn)定，主要分為兩種：單極或雙極細胞 ，胞體類似圓形，突起細長，排列不規(guī)則，突起互相交織成網(wǎng)狀，這種細胞數(shù)量zui多；還有一種“煎蛋樣”細胞，胞核大，胞質(zhì)散鋪圍繞在胞核周圍， 邊界不規(guī)則， 突起不明顯，形狀很似荷包蛋,故稱“煎蛋樣”細胞。這種細胞也較常見。這兩種細胞常獨立成片，少見交叉生長。
神經(jīng)元胞體大，數(shù)量少，容易辨認。另外，還可見扁平長梭形細胞緊密貼壁，片狀生長，分裂迅速，此為成纖維細胞，這種細胞在*剝離外膜的狀況下并不多見。還有一種多突起呈星狀的細胞, 為星形膠質(zhì)細胞, 此類細胞數(shù)量極少, 單個出現(xiàn), 容易辨認。
嗅鞘細胞的純度隨培養(yǎng)時間的延長有所下降, 其zui主要的原因是雜細胞的生長及雜質(zhì)的增多, 主要是成纖維細胞的生長，還有一些膠質(zhì)細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長, 殘留的部分成纖維細胞迅速增殖，造成污染。且雜質(zhì)增多，使視野不清，純度下降。
不同的培養(yǎng)板OECs的形態(tài)有所不同，在未經(jīng)多聚右旋賴氨酸處理的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)的嗅鞘細胞，不但細胞增殖能力差，細胞形態(tài)與經(jīng)賴氨酸處理過的培養(yǎng)板培養(yǎng)的細胞形態(tài)也有很大差別，細胞突起不能*伸展，變的粗短，沒有明顯的細長突起編織成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
研究表明，經(jīng)多聚右旋賴氨酸包被的培養(yǎng)板比多聚左旋賴氨酸處理的培養(yǎng)板更利于嗅鞘細胞的生長。