【實驗?zāi)康摹?/div>
1、 了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。
2、 學(xué)習(xí)細(xì)胞計數(shù)、營養(yǎng)液的配制等，初步掌握無菌操作方法。
3、了解細(xì)胞損傷的過程及死活細(xì)胞的鑒定方法。
【實驗原理】
（一） 細(xì)胞原代培養(yǎng)
原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到*次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個游離細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。
細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。
（二） 細(xì)胞死活鑒定
在顯微鏡下活細(xì)胞細(xì)胞膜完整、立體感強(qiáng)，胞質(zhì)透明度好，顆粒狀物質(zhì)少;死細(xì)胞膜破裂，無立體感，細(xì)胞通透性差，有顆粒狀物質(zhì)、空泡。
培養(yǎng)好的細(xì)胞培養(yǎng)液顏色呈土黃色，透明度好，不渾濁，發(fā)亮，有渾濁可能是污染初期或細(xì)胞太多。
染色排除法是生物研究中判斷細(xì)胞活性的一種常用方法，簡便，易于操作實驗是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來進(jìn)行的。原理：因為活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過性，細(xì)胞不需要的物質(zhì)通常不能進(jìn)入細(xì)胞，染色劑中如臺盼藍(lán)就不能進(jìn)入細(xì)胞，因此用該染色劑處理細(xì)胞后，細(xì)胞不會被染色，由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜是全透性的，因此臺盼藍(lán)能進(jìn)入死細(xì)胞，從而可以使死細(xì)胞染色。依此染色便可以判斷細(xì)胞的活性。
活細(xì)胞必需通過控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞膜來保持內(nèi)部生理環(huán)境的穩(wěn)定性。細(xì)胞死后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，原先不能進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)也能夠進(jìn)入細(xì)胞。常見的細(xì)胞燃料有：中性紅、臺盼藍(lán)、甲基藍(lán)、美藍(lán)、熒光素雙醋酸酯等。臺盤藍(lán)染料正常情況下被活細(xì)胞阻攔在細(xì)胞膜外，只有細(xì)胞膜受損或者細(xì)胞死亡后，才能進(jìn)入細(xì)胞，從而與解體的DNA結(jié)合，使其著色，因此，活細(xì)胞一般不能被臺盤藍(lán)染色，而死細(xì)胞會被染成藍(lán)色。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡被染色的細(xì)胞，并可用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。伊紅和蘇木精是zui常用的細(xì)胞染色劑。伊紅在很多生物技術(shù)中都有應(yīng)用。伊紅有自發(fā)熒光特性。懸液中細(xì)胞的計數(shù)，往往采用*。
熒光排除法 生活力強(qiáng)的細(xì)胞能發(fā)出強(qiáng)烈的黃綠色熒光;生活力的細(xì)胞發(fā)出熒光也較弱;死亡細(xì)胞無熒光。
【實驗器材】
解剖剪，解剖鑷，棉球，培養(yǎng)皿，酒精燈，75%酒精，移液槍，無菌操作臺，培養(yǎng)箱，正置光學(xué)顯微鏡，倒置光學(xué)顯微鏡，吸管，解剖盤，滴管，離心管，離心機(jī)，注射器，塑料培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，*等。
【實驗材料】
小鼠1只，細(xì)胞培養(yǎng)液（含生長因子），Trypen Blue染液，PBS緩沖液
【實驗步驟】
（一） 細(xì)胞的原代培養(yǎng)
1. 取材：
取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。
2. 分離脾細(xì)胞：
用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用’L’型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用’L’型針頭輕輕刮出脾細(xì)胞。在均勻吹勻脾臟細(xì)胞。
吸取上述分離的單個脾細(xì)胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。
3. 培養(yǎng)脾細(xì)胞：
取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標(biāo)記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，吸取200ul脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（二） 細(xì)胞死活鑒定及計數(shù)
1. 試劑配制：用生理鹽水配成4%Tyrpen Blue染液，備用。
2. 染色計數(shù)：
取0.5mL細(xì)胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液?；旌?。2min后將細(xì)胞放在*上觀察死活情況。
3. 計數(shù)：
在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算*的中間方格四角和中間5個小方格的細(xì)胞數(shù)量。包括細(xì)胞總數(shù)與死細(xì)胞數(shù)量。壓線者計上不計下，計左不計右。
4. 計算細(xì)胞活力：
根據(jù)公式：
活細(xì)胞率（%）={（細(xì)胞總數(shù)—死細(xì)胞數(shù)）細(xì)胞總數(shù)}*100%
【實驗結(jié)果】
Tyrpen Blue染液，活細(xì)胞不會被染色而呈無色，死細(xì)胞會被其染色而呈藍(lán)色。
顯微鏡下觀察結(jié)果：
表格
計算結(jié)果：
死細(xì)胞 個ml
活細(xì)胞 ml
活細(xì)胞率 %
死細(xì)胞率 %
細(xì)胞活力 %
【注意事項】
1、嚴(yán)格進(jìn)行動物消毒，需用75%酒精消毒。
2、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。
3、吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒;吸取液體時，避免碰撞。
4、離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。
5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關(guān)閉工作窗。
6、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。
【分析總結(jié)】
染色時間過長，或觀察時間過長都會導(dǎo)致染色試劑將細(xì)胞殺死，使細(xì)胞活力驟降。
