大鼠Smad4實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠Smad4水平。用純化的大鼠Smad4抗體包
被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Smad4，再與HRP標(biāo)記的Smad4
抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在
HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的
Smad4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準曲線計算樣品
中大鼠Smad4濃度。
大鼠Smad4試劑盒組成
1 30倍濃縮洗滌液 20ml×1瓶 7 終止液 6ml×1瓶
2 酶標(biāo)試劑 6ml×1瓶 8 標(biāo)準品（8ng/ml） 0.5ml×1瓶
3 酶標(biāo)包被板 12孔×8條 9 標(biāo)準品稀釋液 1.5ml×1瓶
4 樣品稀釋液 6ml×1瓶 10 說明書 1份
5 顯色劑A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2張
6 顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個
大鼠Smad4標(biāo)本要求
1．標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
大鼠Smad4操作步驟
1. 標(biāo)準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
4ng/ml 5號標(biāo)準品 150µl 的原倍標(biāo)準品加入150µl標(biāo)準品稀釋液
2ng/ml 4號標(biāo)準品 150µl 的5號標(biāo)準品加入150µl標(biāo)準品稀釋液
1ng/ml 3號標(biāo)準品 150µl 的4號標(biāo)準品加入150µl標(biāo)準品稀釋液
0.5ng/ml 2號標(biāo)準品 150µl 的3號標(biāo)準品加入150µl標(biāo)準品稀釋液
0.25ng/ml 1號標(biāo)準品 150µl 的2號標(biāo)準品加入150µl標(biāo)準品稀釋液
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準孔、
待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準品準確加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，
然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此
重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50µl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
10分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50µl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止
液后15分鐘以內(nèi)進行。
