Western Blot樣品處理方法

1．培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）：

  ⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

  ⑵ 對(duì)于6孔板來(lái)說(shuō)每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

  ⑶ 100℃，1min。

  ⑷ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。

  ⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無(wú)團(tuán)塊也無(wú)絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復(fù)抽吸來(lái)降低溶液粘滯度，便于上樣。

  ⑹ 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。

2．培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）：

  ⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。

  ⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。

⑷ 12000g離心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3．組織：

  ⑴ 勻漿  對(duì)于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液?？墒謩?dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM

由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。

1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巰基乙醇，0.2~0.5‰溴酚藍(lán)，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過10%。

對(duì)于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)