酶聯(lián)免疫（ELISA）使用試劑盒檢測過程中值得關(guān)注的問題  

1、儀器質(zhì)控
 為使儀器保持*工作狀態(tài)，應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。
◎移液器： ELISA加樣量?。?/font>20-200μl），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±5%以內(nèi)；
◎恒溫箱： 經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機(jī)： 每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定，一般不超過2μl；人工扣板時，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；
◎酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。

2、試劑盒選擇
◎應(yīng)盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門審核認(rèn)可，試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、安全性及經(jīng)濟(jì)性全面評價。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。
◎特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測定結(jié)果升高，可能導(dǎo)致假陽性，所以交叉反應(yīng)是評價其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。
◎精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時考察線性范圍。
◎準(zhǔn)確度：通過添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項(xiàng)指標(biāo)的前題下，實(shí)驗(yàn)和測定步驟越少越好，在定性實(shí)驗(yàn)中結(jié)果判斷簡單明了，定量試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算也應(yīng)簡單。
◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。
◎經(jīng)濟(jì)性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進(jìn)步降低成本，而市場價格比較合理。
◎試劑評價：需要有的確證方法和確證的樣品進(jìn)行檢測。

3、樣本前處理注意事項(xiàng)
3.1 均質(zhì)
組織樣本:肉、肝食品類切細(xì)，用絞肉機(jī)反復(fù)絞碎，混合均勻。
水產(chǎn)樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細(xì)，用均質(zhì)器均漿；原料表面較臟時,需適當(dāng)用蒸餾水清洗。
蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。
水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振蕩提取
 將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部，提取待測組分。
3.2.1振蕩方式：振蕩器上進(jìn)行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。
3.2.2 在組織樣本中加入有機(jī)溶劑之間提取時，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團(tuán)，不利于提取。
3.3. 在用有機(jī)溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：①用細(xì)頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。②再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。
3.4 濃縮
 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機(jī)溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮?dú)庀麓蹈桑儆脧?fù)溶液溶解干燥殘留物。
濃縮方式：
 氮?dú)獯蹈沙s、壓縮空氣吹干除雜。
注意：
3.4.1在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。
3.4.2在吹樣本時，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。
3.4.3樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時間過長，影響zui終檢測結(jié)果。
3.4.4不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。
3.5 凈化
 經(jīng)過提取的待測組分中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)。將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的zui常見的凈化是：液液分配法。
 比如：用復(fù)溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復(fù)溶液渦動后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以60℃水浴加熱，至乳化現(xiàn)象消失或減弱后，加大離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心。
 實(shí)例：
 A、*類藥物試劑盒現(xiàn)有的水產(chǎn)樣本前處理方法中，用二氯甲烷作為提取劑。
注意：
 （a）二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要求取適量的下層吹干。
 （b）在用加樣器吸取下層的有機(jī)相時，正常操作往往取量不準(zhǔn)確，此時用帶有刻度，且刻度較準(zhǔn)確的玻璃管來定量。
 （c）上訴情況對有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)員還可以通過靈活控制加樣器來控制取樣的準(zhǔn)確性。
 （d）在振蕩過程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過程中，如果離心管密封性不是很好，往往容易爆開；在進(jìn)行振蕩時，不要讓離心管口對準(zhǔn)自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。
 （e）試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項(xiàng)目曲線受影響較明顯。
    B、硝基呋喃代謝物檢測過程中常見問題
    硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）和1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）在檢測過程中也需要同其它項(xiàng)目一樣進(jìn)行添加回收測評，其中需要注意以下幾個問題。
    代謝物在組織中是與蛋白呈結(jié)合狀態(tài)，采用普通的有機(jī)溶劑或緩沖液，是無法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類代謝物游離，所以在加入去離子水、鹽酸和2-硝基苯甲醛（2-NBA）混合均勻后，其pH應(yīng)在1-3之間，否則不利用水解代謝物。
在衍生化過程中，溫度和時間決定其衍生化產(chǎn)率，衍生化后在加入氫氧化鈉和*時，其pH應(yīng)在中性左右。由于部分樣本的緩沖能力不同，所以需對其pH進(jìn)行測定，因?yàn)樵谒嵝曰驂A性環(huán)境中，不利于呋喃類代謝物的提取回收，同時也容易出現(xiàn)假陽性。
    添加回收的幾種誤區(qū)：
    呋喃類代謝物提取過程通常分三個關(guān)鍵步驟：
 水解-----衍生化-----提取
 （1）采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的zui大標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行添加回收。如德國拜發(fā)和我公司AOZ試劑盒中的第6個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)8.1ppb。因?yàn)檫@些標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)過衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品，不能代表樣本前處理實(shí)驗(yàn)中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個步驟，所以就算回收率很高，但失去了實(shí)際參考價值。
 （2）*依賴未衍生的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標(biāo)準(zhǔn)品后有一定的有效期，會存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個關(guān)鍵點(diǎn)，不能驗(yàn)證從組織蛋白中水解呋喃類代謝物的過程，因此也有一定的局限性。
 的評價方案：采用經(jīng)LC-MS-MS確證的陰陽性樣品，留作質(zhì)控樣品，對檢測的樣本和試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評價。這也是實(shí)驗(yàn)室所出數(shù)據(jù)可信度說服力的關(guān)鍵點(diǎn)。

4、 酶標(biāo)分析過程中的注意事項(xiàng)
     樣本的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定樣本zui終的藥物含量。它要求加樣的準(zhǔn)確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實(shí)驗(yàn)室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進(jìn)行。
4.1常見加樣方式
A、吸一打二
B、吸二打一
 在實(shí)際操作過程中，提倡用“吸二打一”用這種方式，有如下幾個好處：
 a、加樣過程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡
 b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時間差。
在加樣的過程中還應(yīng)細(xì)心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：
A、加樣的過程中漏加或者重加；
B、加樣的過程中忘記更換吸頭；
C、樣本的重加或者漏加；
D、忘記記錄樣本的加樣順序。
4.2常見的洗板方式
A、洗板機(jī)洗板；
B、多道孔加樣器洗板；
C、多孔吸頭洗板；
   在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過少，則達(dá)不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。
4.3 甩板
 快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。
4.4拍板
 輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。
4.5 顯色
 值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時間是的，因?yàn)樵噭┖械奈舛戎禃墉h(huán)境中的溫度、濕度、酶標(biāo)板反應(yīng)時所接觸到的物品的導(dǎo)熱度等有關(guān)，實(shí)驗(yàn)操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)顏色的深淺適當(dāng)?shù)难娱L或者縮短顯色時間。防止出現(xiàn)吸光值接近或高于酶標(biāo)儀的zui高檢測靈敏度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會間接影響到檢測結(jié)果，如出現(xiàn)曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數(shù)值等現(xiàn)象，也就造成了一些假陽性或部分檢測結(jié)果偏低的現(xiàn)象。
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