ELISA試劑盒研究酶免疫技術的特點和優(yōu)勢

    ELISA試劑盒酶免疫技術是利用酶催化底物反應的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學反應檢測敏感性的一種標記免疫技術。該技術所用的酶要求純度高、催化反應的轉化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物
    .辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約8%；分子量為44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，
    在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H202方便。
    2.堿性磷酸酶（AP）：ELISA試劑盒是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般采用對**苯***（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。
    在ELISA中應用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結合物時得率較HRP低等原因，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應用可產(chǎn)生熒光的傘基***作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶。
二、酶標記抗體或抗原
    酶標記的抗原或抗體稱為結合物（conjugate）?？乖捎诨瘜W結構不同，可用不同的方法與酶結合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結合物的方法通常有以下幾種。
    .戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復性好。缺點是交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。
    2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含8%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用***鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結合，形成按摩爾比例結合的酶標結合物。有人認為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈，各批實驗結果不易重復。
按以上方法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游離酶不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因而減低結合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結合物應予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。
    3.標記抗體鑒定：通常采用棋盤滴定法進行篩選，見第十九章。
三、ELISA試劑盒固相載體
    酶免疫技術的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關聯(lián)的酶反應底物?？勺鞴滔噍d體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式，在測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學反應，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
    聚苯乙烯載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點是還能兼作反應的容器，zui后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量反應板，于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，通用的標準板形是8×2的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)或l2聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。
    良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為0ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應小于0%.與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
四、免疫吸附劑
    固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。ELISA試劑盒將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA試劑盒ELISA板孔中在4℃夜，經(jīng)清洗后即可應用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標本和酶結合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。