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小鼠心臟微血管周分離自心臟組織；心臟是脊椎動(dòng)物身體中最重要的一個(gè)器官，主要功能是為血液流動(dòng)提供壓力，把血液運(yùn)行至身體各個(gè)部分。心臟由心肌構(gòu)成，左心房、左心室、右心房、右心室四個(gè)腔組成。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開，故互不相通，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣），這些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。心臟的作用是推動(dòng)血液流動(dòng)，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機(jī)鹽、尿素和尿酸等），使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞是組成心臟微血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞，它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在心臟血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要病理生理學(xué)意義。近年來大量研究表明，心肌微血管周細(xì)胞的功能和病理改變直接影響心肌細(xì)胞功能，也是諸多毒素、炎癥因子及病毒等重要靶位，其作為體外研究的細(xì)胞模型在心肌缺血-再灌注發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞間旁分泌細(xì)胞生長因子研究中起著重要作用。
方法簡介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠心臟微血管周采用膠原酶消化法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠心臟微血管周經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-3代左右

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準(zhǔn)備工作

1. 實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備無菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術(shù)器械等，并進(jìn)行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準(zhǔn)備：配制或購買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無菌且在有效期內(nèi)。

3. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或組織來源準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的動(dòng)物并進(jìn)行相應(yīng)的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無菌條件下，迅速取出目標(biāo)組織，盡量減少對組織的損傷，并去除多余的脂肪、結(jié)締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預(yù)冷的無菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質(zhì)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細(xì)胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫?fù)u床或培養(yǎng)箱中消化一段時(shí)間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當(dāng)組織塊大部分被消化成單細(xì)胞懸液或小細(xì)胞團(tuán)時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過濾與離心：用細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心，收集細(xì)胞沉淀。

細(xì)胞觀察與檢測

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)、密度等，記錄細(xì)胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染或異常，及時(shí)采取相應(yīng)措施。
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測：在需要時(shí)，可采用臺(tái)盼藍(lán)染色等方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力檢測，以了解細(xì)胞的生長情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長時(shí)間暴露于室溫或非營養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質(zhì)。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

- 消化時(shí)間需嚴(yán)格控制（通常 10-30 分鐘），可通過顯微鏡觀察細(xì)胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細(xì)胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細(xì)胞適應(yīng)壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細(xì)胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時(shí)密度建議控制在 70%-80%，過度匯合會(huì)導(dǎo)致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無菌操作

- 全程在超凈臺(tái)操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長期使用可能影響細(xì)胞活性。

2. 支原體檢測

- 定期檢測支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時(shí)丟棄細(xì)胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細(xì)胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時(shí)更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細(xì)胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細(xì)胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時(shí)凍存早期代次細(xì)胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或?qū)Ｓ脙龃媾囵B(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。