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人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮分離自視網(wǎng)膜組織；視網(wǎng)膜居于眼球壁的內(nèi)層，是一層透明的薄膜。視網(wǎng)膜由色素上皮層和視網(wǎng)膜感覺層組成，兩層間在病理情況下可分開，稱為視網(wǎng)膜脫離。色素上皮層與脈絡(luò)膜緊密相連，由色素上皮細(xì)胞組成，它們具有支持和營(yíng)養(yǎng)光感受器細(xì)胞、遮光、散熱以及再生和修復(fù)等作用。組織學(xué)上視網(wǎng)膜分為10層，由外向內(nèi)分別為：色素上皮層、視錐、視桿細(xì)胞層、外界膜、外顆粒層、外叢狀層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)界膜。視網(wǎng)膜內(nèi)層為襯于血管膜內(nèi)面的一層薄膜，有感光作用；后部鼻側(cè)有一視神經(jīng)乳頭。視網(wǎng)膜上的感覺層是由三個(gè)神經(jīng)元組成。神經(jīng)元是視細(xì)胞層，專司感光，它包括錐細(xì)胞和桿細(xì)胞。視桿細(xì)胞主要在離中心凹較遠(yuǎn)的視網(wǎng)膜上，而視錐細(xì)胞則在中心凹處最多。第二層叫雙節(jié)細(xì)胞，約有10到數(shù)百個(gè)視細(xì)胞通過(guò)雙節(jié)細(xì)胞與一個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相聯(lián)系，負(fù)責(zé)聯(lián)絡(luò)作用。第三層叫節(jié)細(xì)胞層，專管傳導(dǎo)。視網(wǎng)膜是一層菲薄的但又非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它貼于眼球的后壁部，傳遞來(lái)自視網(wǎng)膜感受器沖動(dòng)的神經(jīng)纖維跨越視網(wǎng)膜表面，經(jīng)由視神經(jīng)到達(dá)出口。視網(wǎng)膜的分辨力是不均勻的，在黃斑區(qū)，其分辨能力強(qiáng)。它是組成血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞，它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對(duì)維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要病理生理學(xué)意義。由于從不同的組織和器官獲得的內(nèi)皮細(xì)胞具有不同的特性，在腦和視網(wǎng)膜中，這些內(nèi)皮細(xì)胞具有內(nèi)屏障的功能，在調(diào)節(jié)血管生理狀態(tài)，釋放血管活性物質(zhì)以及新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用，體外分離培養(yǎng)RCEC對(duì)研究視網(wǎng)膜血管性疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制以及疾病的早期防治具有重要臨床意義。
方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮采用膠原酶-中性dan白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、最后通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準(zhǔn)備工作

1. 實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備無(wú)菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術(shù)器械等，并進(jìn)行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準(zhǔn)備：配制或購(gòu)買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無(wú)菌且在有效期內(nèi)。

3. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或組織來(lái)源準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的動(dòng)物并進(jìn)行相應(yīng)的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫(kù)中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無(wú)菌條件下，迅速取出目標(biāo)組織，盡量減少對(duì)組織的損傷，并去除多余的脂肪、結(jié)締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預(yù)冷的無(wú)菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質(zhì)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細(xì)胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫?fù)u床或培養(yǎng)箱中消化一段時(shí)間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當(dāng)組織塊大部分被消化成單細(xì)胞懸液或小細(xì)胞團(tuán)時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過(guò)濾與離心：用細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心，收集細(xì)胞沉淀。

細(xì)胞觀察與檢測(cè)

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)、密度等，記錄細(xì)胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染或異常，及時(shí)采取相應(yīng)措施。
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)：在需要時(shí)，可采用臺(tái)盼藍(lán)染色等方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)，以了解細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于室溫或非營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無(wú)菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質(zhì)。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過(guò)度消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

- 消化時(shí)間需嚴(yán)格控制（通常 10-30 分鐘），可通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細(xì)胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細(xì)胞適應(yīng)壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細(xì)胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時(shí)密度建議控制在 70%-80%，過(guò)度匯合會(huì)導(dǎo)致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無(wú)菌操作

- 全程在超凈臺(tái)操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長(zhǎng)期使用可能影響細(xì)胞活性。

2. 支原體檢測(cè)

- 定期檢測(cè)支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時(shí)丟棄細(xì)胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細(xì)胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時(shí)更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細(xì)胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營(yíng)養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細(xì)胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時(shí)凍存早期代次細(xì)胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或?qū)Ｓ脙龃媾囵B(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。