人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用                                    

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中BDNF含量。

概述

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是1982年德國神經(jīng)生物學(xué)家從豬腦中分離出來的小分子蛋白質(zhì)，因豬、人、小鼠和人類的BDNF具有*相同的氨基酸編碼序列，且與神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）序列具有驚人的相似性,故被歸屬為神經(jīng)生長因子家族成員。BNDF是由120個氨基酸組成的一種堿性蛋白，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，是由神經(jīng)元的靶細(xì)胞分泌，逆向營養(yǎng)神經(jīng)元，BNDF對神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育及保護(hù)修復(fù)有重要作用,其生物學(xué)效應(yīng)主要由二種類型的跨膜糖蛋白介導(dǎo)，一種是高親和力受體TrKB，另一種是低親合力神經(jīng)營養(yǎng)素受體（LNGFR），其中TrKB是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。TrKB的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)與BNDF結(jié)合后可發(fā)生自磷酸化，繼而發(fā)生一系列底物磷酸化反應(yīng)，實現(xiàn)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信息傳遞而引起細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng), TrKB主要表達(dá)在腦中。目前BDNF被認(rèn)為是抗凋亡劑、抗氧化劑和鈣通道阻滯劑。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中BDNF水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入BDNF抗原、*化的抗人BDNF抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的BDNF呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，為進(jìn)一步去除血漿中血小板，請再次2 - 8° C 1000 x g離心10分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：血小板中含BDNF，并其將會隨著血小板的活化而釋放入血。因此欲測定循環(huán)量BDNF量，須先盡量去除標(biāo)本中血小板。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人BDNF，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4．  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

156 pg/mL -10000 pg/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

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