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人表皮生長因子(EGF)ELISA試劑盒使用說明書

2010年01月26日 18:54:36人氣:485來源:廈門慧嘉生物科技有限公司

表皮生長因子(EGF)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關液體中表皮生長因子(EGF)含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中EGF水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被抗體的微孔中依次加入EGF抗原、*化的抗人EGF抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的EGF呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板:一塊(96孔)

標準品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為1,000 pg/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成1,000 pg/ml,500 pg/ml 250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.2 pg/ml15.6 pg/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制500 pg/ml標準品:取0.5ml 1,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

2.         樣品稀釋液1×20ml/瓶。

3.         檢測稀釋液A1×10ml/瓶。

4.         檢測稀釋液B1×10ml/瓶。

5.         檢測溶液A1×120ul/瓶(1100)臨用前以檢測稀釋液A 1100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。

6.         檢測溶液B1×120ul/瓶(1100)臨用前以檢測稀釋液B1100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

7.         底物溶液:1×10ml/瓶。

8.         洗滌液1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

9.         終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

標本的采集及保存

1.血清:標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,但應避免反復凍融。

2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。

注:標本溶血會影響zui后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

操作步驟

實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37反應120分鐘。

為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(取1ul檢測溶液A99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,37,60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,37避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(此時藍色立轉黃色)。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

1 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜。

3.  未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.  建議檢測樣品時均設雙孔測定,以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層

紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需

要,重復此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人表皮生長因子(EGF),且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

注意事項

1.  洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。

2.  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

3.  請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。

4.  如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,不能混淆。

6.底物請避光保存。

 

檢測范圍:

15.6 pg/ml -1000 pg/ml

說明

1.試劑盒保存:-20(較長時間不用時);2-8(頻繁使用時)。

2.有效期:6個月

3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結果造成任何影響。

5.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。

 

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