人β淀粉樣蛋白1-40（Aβ1-40）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中β淀粉樣蛋白1-40（Aβ1-40）含量。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被單抗的微孔中依次加入標本或標準品、*化的抗Aβ1-40抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Aβ1-40呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml ，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.8 pg/ml，9.4 pg/ml，4.7 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制150 pg/ml標準品：取0.5ml 300 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

2.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

3.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

4.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

5.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

6.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

7.         底物溶液：1×10ml/瓶。

8.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

9.         終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1.  細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。

2.  血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存，但應避免反復凍融。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周，如需長期保存，請置-20℃密封保存，但也不應超過3個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.         嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。

3.         洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，洗板拍干后請立即加入后步試劑，應避免微孔干燥掉。

4.         消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

5.         底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

6.         在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.         未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

8.         建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需

要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人Aβ1-40，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6. 底物請避光保存。

檢測范圍：

4.7 pg/ml -300 pg/ml

zui低檢測限：2.4 pg/ml

說明

1.          在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.          小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。

3.          試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時，僅適用于部分試劑，具體見標簽）；2-8℃（頻繁使用時）。

4.          有效期：6個月

5.          濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

6.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

7.          中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

8.          所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

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