豬白細(xì)胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用                                    

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定豬血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、肺泡盥洗液等其它相關(guān)液體中IL-8含量。

概述

白細(xì)胞介素（IL-8）是1987年首先在受脂多糖刺激的豬單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分離提純的一種堿基肝素結(jié)合蛋白，具有內(nèi)源性白細(xì)胞趨化和活化作用，zui初命名為單核細(xì)胞源性中性細(xì)胞趨化因子（monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF），1998年被正式統(tǒng)一命名為中性粒細(xì)胞活化肽/IL-8（NAP/IL-8）。IL-8屬于CXC型亞家族，又因其氨基酸*個(gè)半*前有*-*-*而稱為ELR⁺-CXC型趨化因子。IL-8是一種可由多細(xì)胞來源的多功能趨化因子，其生物學(xué)功能無種屬特異性，除具有特異性使中性粒細(xì)胞離開血流游走到炎癥組織，脫顆粒，產(chǎn)生超氧陰離子，引起呼吸爆發(fā)外，還顯示出促血管生成的活性，可參與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及血管生成。此外，IL-8對(duì)淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞也有趨化和活化作用。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中IL-8水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IL-8抗原、*化的抗豬IL-8抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-8呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，充分混和后其濃度為1000pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成500 pg/mL，250 pg/mL ，125 pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6 pg/mL，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A1：100稀釋。

7.         檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)后于1000 x g離心30分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：標(biāo)本可采用肝素、EDTA或枸櫞酸鹽做為抗凝劑。標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)1000 x g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的豬IL-8。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

靈敏度

本試劑盒測(cè)定豬IL-8的zui小可檢測(cè)檢測(cè)濃度（MDD），其值一般約為0.28 pg/mL

注意事項(xiàng)

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4．  如標(biāo)本中IL-8含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

檢測(cè)范圍：

15.6 pg/mL – 1000 pg/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

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