人*抗體（GM1）IgM試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

zui低檢測(cè)限：1 ng/ml

特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)人GM1 （IgM），且與其他相關(guān)抗體無交叉反應(yīng)。

有效期：6個(gè)月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法半定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中GM1 （IgM）含量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理

用GM1抗原包被酶標(biāo)板，制成固相載體。向微孔中先加入待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng)，然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GM1 （IgM）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品中抗體的效價(jià)（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價(jià)）。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。

2.         樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

3.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM稀釋液 （HRP-anti-human IgM Diluent）：1×10ml/瓶。

4.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM（HRP-anti-human IgM）：1×120μl/瓶（1：100）。

5.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

6.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

7.         終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1.         標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.         高速離心機(jī)

3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.         干凈的試管和Eppendof管

5.         系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1.         血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.         細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算抗體效價(jià)時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本中抗體的效價(jià)為“N”。

辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100μl，余孔加待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM工作液 100μl（取1μl*標(biāo)記抗體加99μl*標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃，60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.         依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍(lán)色，即可終止）。

5.         依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

6.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgM工作液。

5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

計(jì)算

為檢測(cè)樣品中GM1 （IgM）效價(jià)，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計(jì)算抗體效價(jià)，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋）。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗(yàn)要求而定，zui終顯色與陰性對(duì)照孔進(jìn)行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價(jià)。

注意事項(xiàng)

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5. 在配制檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6. 底物請(qǐng)避光保存。

7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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