豬可溶性P-選擇素（sP-selectin）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用                                    

預期應用

ELISA法定量測定豬血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中sP-selectin含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中sP-selectin水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入sP-selectin抗原、*化的抗豬sP-selectin抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的sP-selectin呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為100 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成100 ng/mL，50 ng/mL ，25 ng/mL，12.5 ng/mL，6.2 ng/mL，3.1ng/mL，1.6 ng/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         抗體稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         抗體稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液A1：100稀釋。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液B1：100稀釋。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。

2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存，但應避免反復凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的豬sP-selectin，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4．  如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

0.15 ng/mL -200 ng/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

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