上海華壹生物科技有限公司作者
實(shí)驗(yàn)步驟
一、提取
糧食類(花生、玉米等):稱取20g粉碎過篩樣品(面粉不需粉碎)。置于250ml具塞錐形中,加30ml正已烷或石油醚和100ml甲醇-水溶液,潤(rùn)濕瓶塞,蓋緊顏漏,振搖30min,靜置分層,以疊成折疊式快速定性濾紙過濾于帶刻度的125ml分液漏斗中,待下層甲醇-水溶液分清后,放出20ml甲醇-水溶液于第二個(gè)125ml分液漏斗內(nèi),并加入20ml三氯甲烷,振搖2min。靜置分層,如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加少許甲醇促使分層,將三氯甲烷層通過裝有約10g*玻璃漏斗后,流入全玻璃濃縮瓶中,然后用數(shù)毫升三氯甲烷洗滌*層,一并收集于濃縮瓶?jī)?nèi),在60~70℃水浴中減壓濃縮至干后,用苯-乙腈混合液定容至1.0ml,即為分析樣液。
花生油、香油、菜油等:稱取4 g油樣于小燒杯中,用20ml正已烷或石油醚將油樣全部轉(zhuǎn)至125ml刻度分液漏斗中,再用20ml甲醇-水分次洗燒杯,洗液一并轉(zhuǎn)至上述分液漏斗內(nèi),振搖2min,靜置分層后,將下層甲醇-水放入第二個(gè)125ml刻度分液漏斗中,在原分液漏斗中再加5ml甲醇-水溶液重復(fù)提取一次,提取液一并移入第二個(gè)分液漏斗中,并在第二分液漏斗中加入20ml三氯甲烷,以下按“花生、玉米等糧食類”自“振搖2min,靜置分層”起依法操作。
二、薄層層析
(1)、薄層板的制備:稱取約14g硅膠G加36~40ml水,在研缽中研成糊狀后立即倒入涂布器內(nèi),可涂成厚度約0.25mm的5 cm×20cm玻璃板8塊,或10cm×20cm玻璃板4塊,或20cm×20cm玻璃板2塊,室溫干燥約15min后,置105~110℃烘箱內(nèi)活化1 h,取出,放于干燥器內(nèi)備用,放置時(shí)間超過一周時(shí),需重新活化后再用。
(2)、初步層析與確證
(2)-1、衍生物法:黃曲霉毒素B1和G1能與二氟乙酸反應(yīng)產(chǎn)生衍生物(其比移值B1>G1)。B2、G2不起反應(yīng)。于一塊5 cm×20cm的薄層板上,以距薄層板下端3 cm為基線,自左端約1 cm起沿基線1 cm等距點(diǎn)四個(gè)點(diǎn),*點(diǎn)為2μl標(biāo)準(zhǔn)混合使用液;第二點(diǎn)為20μl樣液;于以上兩點(diǎn)各加三氟乙酸1小滴,反應(yīng)5min后,用低于40℃熱風(fēng)吹2min,冷卻后,再依次點(diǎn)第三點(diǎn)為2μl混合標(biāo)準(zhǔn)使用液;第四點(diǎn)為20μl樣液;吹干。將薄層板放入裝有10ml乙醚的展開槽內(nèi),展至13cm處,取出吹干后,再用10ml丙酮-三氯甲烷(1+9)展開劑再展一遍,取出吹干后,在紫外光下觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1、G1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物,未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn),可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。
(2)-2、黃曲霉毒素G1和G2的確證:可用苯-乙醇-水(46+35+19)展開,若標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液點(diǎn)出現(xiàn)重疊,即可確定。
(2)-3、在展開的薄層板上噴以硫酸(1+3),吹干后,則黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2都變?yōu)辄S色熒光。
三、定量測(cè)定:經(jīng)確證的陽性樣品進(jìn)行薄層分離和定量測(cè)定。
(1)、連續(xù)層析法
*點(diǎn)板:將10cm×20cm的薄層硅膠板用橡皮刮塞刮去左右兩邊硅膠層各1 cm,以距底邊1.5cm處為基線。自左1 cm開始,以1 cm間距依次滴加黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1,3,5,7,10μl,依次相當(dāng)于B1、G1 0.2,0.6,1.0,1.4,2.0ng;B2、G2 0.1,0.3,0.5,0.7,1.0 ng和樣液點(diǎn)。滴加樣液體積依樣品含黃曲霉毒素含量而定。
**展開:室溫20℃,相對(duì)濕度約70%條件下,按以下條件進(jìn)行連續(xù)層析分離。
乙醚飽和:7min;
預(yù)展:10min;
丙酮-三氯甲烷(7+93)飽和:10min;
展開:15min后,取出吹干。
***觀察:于紫外光下,在標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和與標(biāo)準(zhǔn)比移值相同的樣液點(diǎn)下方,用針尖輕刺標(biāo)記,以確定各點(diǎn)的掃描起點(diǎn),然后進(jìn)行掃描測(cè)定。
****雙向展開法
****點(diǎn)板:于20cm×20cm薄板上.
提示:本文植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2測(cè)定方法屬于生化實(shí)驗(yàn)文章,主要介紹黃曲霉方面的知識(shí),內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考.
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