液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用液相色譜來(lái)分析。 

液相色譜的五大進(jìn)樣系統(tǒng)：

1、進(jìn)樣系統(tǒng)
進(jìn)樣系統(tǒng)分為手動(dòng)進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣器。

手動(dòng)進(jìn)樣閥
對(duì)于手動(dòng)進(jìn)樣閥使用過(guò)程中需要注意每個(gè)樣品進(jìn)樣完成后應(yīng)對(duì)進(jìn)樣閥進(jìn)行清洗，防止殘留對(duì)下一個(gè)樣品分析的影響。還需要注意進(jìn)樣方式，以20μL定量環(huán)為例，我們可以選擇*充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進(jìn)樣的重復(fù)性，選擇*充滿定量管進(jìn)樣方式時(shí)，需要注入定量環(huán)體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進(jìn)樣方式時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)在定量管體積一半以下，即1-10μL。

自動(dòng)進(jìn)樣器
如果采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，首先需要保證注射器里面沒(méi)有氣泡存在，否則影響進(jìn)樣量準(zhǔn)確性；其次是樣品瓶里面有足夠的樣品，保證進(jìn)樣針能夠吸到樣品。為了避免交叉污染需要定期對(duì)樣品瓶、蓋和墊進(jìn)行清洗。若自動(dòng)進(jìn)樣器長(zhǎng)時(shí)間不使用，應(yīng)該注意：腐蝕性的流動(dòng)相或洗液(例如，堿性或酸性緩沖溶液)必須*從系統(tǒng)中置換出來(lái)。同時(shí)，為了避免細(xì)菌的生長(zhǎng)，應(yīng)將一個(gè)樣品瓶中充滿甲醇，并重復(fù)幾次進(jìn)樣操作。

2、輸液系統(tǒng)
*按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對(duì)液相色譜分析來(lái)說(shuō)，*的流量穩(wěn)定性更為重要，這是因?yàn)榱魉俚淖兓瘯?huì)引起溶質(zhì)的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。

*按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類(lèi)。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)*、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。

HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：
a 流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為1～10ml/min）；
b 能抗溶劑腐蝕；
c 有較高的輸液壓力；對(duì)一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對(duì)分離，要求達(dá)到150～300×105Pa。

（1）往復(fù)式柱塞泵結(jié)構(gòu)和原理
當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口（上部）的單向閥打開(kāi)，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開(kāi)，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。

（2）氣動(dòng)放大泵結(jié)構(gòu)和原理
其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動(dòng)大面積（SA ）活塞A，則在小面積（SB ）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。

泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞桿。單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成，在壓力的作用下寶石球離開(kāi)閥座，流動(dòng)相流過(guò)單向閥；反之，在反向力的作用下，寶石球回到閥座上，此時(shí)流動(dòng)相不再流過(guò)單向閥，顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動(dòng)相的泄漏。為了保證單向閥不發(fā)生泄漏，一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座，也有一些單向閥是將寶石球用一個(gè)合適的彈簧壓在閥座上。在不同的應(yīng)用領(lǐng)域，單向閥閥體的材料有所不同，例如考慮生物兼容性的系統(tǒng)，單向閥的閥體往往采用金屬鈦，而不用不銹鋼。為了降低成本和減少維護(hù)費(fèi)用，一些生產(chǎn)廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件，當(dāng)然其功能仍保持不變。

輸液系統(tǒng)即是指高壓恒流泵，其作用是能提供穩(wěn)定準(zhǔn)確的流速。

溶劑過(guò)濾頭：吸液過(guò)濾頭，或稱沉子，主要作用是過(guò)濾流動(dòng)相中可能存在的顆粒性雜質(zhì)。長(zhǎng)時(shí)間使用后，雜質(zhì)有可能阻塞溶劑過(guò)濾頭上的過(guò)濾板孔隙;或長(zhǎng)時(shí)間使用緩沖液，過(guò)濾頭表面容易產(chǎn)生一層膜，阻礙流動(dòng)相正常通過(guò)。嚴(yán)重時(shí)，即使是已超聲過(guò)的溶劑，泵吸液時(shí)也會(huì)有氣泡在四氟輸液管里產(chǎn)生，因此應(yīng)經(jīng)常對(duì)過(guò)濾頭進(jìn)行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。

單向閥：?jiǎn)蜗蜷y的作用是確保液體向一個(gè)方向流動(dòng)，是高壓恒流泵穩(wěn)定輸液的保證。日常使用過(guò)程中，可以通過(guò)觀察壓力的情況，初步判斷流量是否正常。如果系統(tǒng)已經(jīng)平衡一段時(shí)間，壓力應(yīng)該是穩(wěn)定的。但如果壓力存在波動(dòng)，則表明流量不穩(wěn)定;如果無(wú)壓力，則表明無(wú)流量。這兩種情況大多是因?yàn)閱蜗蜷y里混入了氣泡或雜質(zhì)?；烊霘馀莸那闆r，應(yīng)把放空閥打開(kāi)，按沖洗鍵將里面的氣泡排出。單向閥混入雜質(zhì)的情況，須對(duì)其進(jìn)行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇，安裝時(shí)注意標(biāo)記環(huán)的方向。

密封圈：密封圈是固定在柱塞桿上防止泵腔內(nèi)的液體泄漏，是保證泵頭輸液正常的關(guān)鍵部件。但柱塞桿和柱塞密封圈長(zhǎng)期使用會(huì)發(fā)生磨損，主要與流量、操作壓力和所使用的流動(dòng)相有關(guān)。當(dāng)使用含鹽的流動(dòng)相時(shí)，由于脫水或蒸發(fā)，可能形成鹽結(jié)晶，而泵運(yùn)動(dòng)時(shí)鹽結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致密封圈和柱塞桿的磨損。因此，每天實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后都需用純水沖洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二級(jí)密封圈之間)，保持清洗管內(nèi)有水以防止形成晶體，延長(zhǎng)柱塞桿和密封圈的使用壽命。

在線過(guò)濾器：為了防止由于流動(dòng)相雜質(zhì)微粒進(jìn)入色譜系統(tǒng)，泵在放空閥內(nèi)安裝了在線過(guò)濾器，經(jīng)泵出口流出的液體通過(guò)在線過(guò)濾器，經(jīng)排空管流出的液體不通過(guò)在線過(guò)濾器。儀器使用一定時(shí)間后，建議用戶清洗在線過(guò)濾器的燒結(jié)不銹鋼過(guò)濾片。用扳手卸下壓帽，將密封環(huán)和燒結(jié)不銹鋼過(guò)濾片一同取出清洗，清洗后按原位裝上。清洗溶劑可以選擇30%稀硝酸溶液，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。

3、分離系統(tǒng)
分離系統(tǒng)包括色譜柱、保護(hù)柱以及柱溫箱。

色譜柱：色譜柱是樣品分離的核心。色譜柱在使用前必須仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，了解色譜柱使用的pH值范圍、溶劑耐受范圍、壓力范圍和維護(hù)方法等事項(xiàng)。色譜柱使用完后，需及時(shí)對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗。沖洗完成后，應(yīng)該將色譜柱從儀器上拆下來(lái)，兩端用廠家配的堵頭密封后，保存在色譜柱盒里。

保護(hù)柱：保護(hù)柱的作用主要是防止吸附性強(qiáng)的雜質(zhì)對(duì)色譜柱污染，從而延長(zhǎng)色譜柱的壽命。針對(duì)不同型號(hào)的色譜柱，應(yīng)選擇相對(duì)應(yīng)填料的保護(hù)柱。應(yīng)注意柱芯也是有壽命的，應(yīng)該定期進(jìn)行更換。

柱溫箱：色譜柱溫度變化，可能會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間的變化。為了避免這個(gè)問(wèn)題，建議使用柱溫箱。

4、檢測(cè)系統(tǒng)
液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。

（1）紫外檢測(cè)器
該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可見(jiàn)光）有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)是，使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）、靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10g/ml）、線性范圍寬、對(duì)溫度和流速變化不敏感、可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測(cè)器
凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前，糖類(lèi)化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7g/ml），流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。

（3）熒光檢測(cè)器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類(lèi)、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定，其靈敏度很高（檢測(cè)下限為10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測(cè)均可采用。

HPLC常用的檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器。在日常使用過(guò)程中紫外檢測(cè)器主要需要注意檢測(cè)池和氘燈的使用與維護(hù)。

檢測(cè)池：檢測(cè)池長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)造成污染，如果儀器的參比能量(REF ENERGY)正常，測(cè)量能量(SMPENERGY)偏低，可能為檢測(cè)池污染導(dǎo)致，可以對(duì)檢測(cè)池進(jìn)行清洗。對(duì)檢測(cè)池零件的進(jìn)行清洗，一般先采用約1：4的硝酸溶液超聲清洗，分別用純水和甲醇溶液清洗，然后重新組裝并將檢測(cè)池池體推進(jìn)池腔內(nèi)，擰緊池板螺絲。注意組裝中，池玻璃及墊片一定要放正，以免壓碎池玻璃，造成檢測(cè)池泄漏。

氘燈：氘燈正常使用壽命可在1500小時(shí)以上。燈的使用壽命與檢測(cè)器的使用時(shí)間和開(kāi)啟頻率有關(guān)，因此使用過(guò)程中應(yīng)盡量節(jié)省不必要的開(kāi)機(jī)時(shí)間，減少開(kāi)關(guān)頻率，以延長(zhǎng)氘燈的使用壽命。如果準(zhǔn)確地判斷出氘燈已經(jīng)不能點(diǎn)亮或能量太低，則需要更換新的氘燈。在購(gòu)買(mǎi)氘燈時(shí)，應(yīng)注意咨詢和核對(duì)氘燈的型號(hào)與儀器型號(hào)是否匹配。更換到氘燈時(shí)，參照儀器說(shuō)明書(shū)中的相關(guān)內(nèi)容，特別要注意氘燈連接線的位置順序。

5、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。

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