1. 長(zhǎng)片段重復(fù)。大量的長(zhǎng)片段重復(fù)很可能會(huì)延長(zhǎng)基因合成的時(shí)間，甚至導(dǎo)致基因*無法合成。
2. 高GC%?；騼?nèi)部的局部高GC%會(huì)嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增和測(cè)序。
3. 二級(jí)結(jié)構(gòu)。堿基序列的反轉(zhuǎn)、重疊等會(huì)嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增，在測(cè)序時(shí)也可能會(huì)因此而測(cè)不通或信號(hào)突然中斷等。
4. 測(cè)序引物與基因內(nèi)部的特殊序列結(jié)合導(dǎo)致無法正常測(cè)序，必須重新設(shè)計(jì)測(cè)序引物。

對(duì)策： 對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，盡量減少基因序列中的重復(fù)序列,高GC%區(qū)和二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。

2.PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

1. 引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。
2. Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多。
3. 酶量過多出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

對(duì)策：

1. 重新設(shè)計(jì)引物。
2. 減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
3. 降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
4. 適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

3.PCR出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

1. 酶量過多或酶的質(zhì)量差。
2. dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多。

對(duì)策：

1. 減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。
2. 減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度，減少循環(huán)次數(shù)。

4. DNA沒有被限制性內(nèi)切酶切開或者切割不*

1. 缺少識(shí)別序列。
2. 反應(yīng)條件不合適。
3. 限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA甲基化敏感。
4. 內(nèi)切酶稀釋不正確或加入方法不正確。
5. 甘油濃度過高。
6. 限制性內(nèi)切酶已部分或全部失活。

對(duì)策：

1. 檢查底物DNA中是否存在可被限制酶識(shí)別的DNA序列。
2. 使用隨酶提供的反應(yīng)緩沖液；增大酶量。
3. 檢查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性內(nèi)切酶是否對(duì)甲基化敏感。
4. 限制性內(nèi)切酶經(jīng)稀釋緩沖液稀釋后應(yīng)在當(dāng)天用完；限制性內(nèi)切酶通常在zui后加入。
5. 更換新酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
6. 酶的體積不能超過反應(yīng)總體積的1/10。

5.電泳后電泳條帶擴(kuò)散，電泳條帶移動(dòng)距離異常

1. 底物DNA不純。
2. 限制性內(nèi)切酶不純。
3. 酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起使電泳條帶移動(dòng)距離異常。

對(duì)策:

1. 用另外一種限制性內(nèi)切酶與底物DNA溫育作為對(duì)照
2. 用產(chǎn)品說明中的底物DNA來檢測(cè)酶活性，如果電泳后條帶仍擴(kuò)散，說明不正確的操作已使內(nèi)切酶污染。
3. 電泳前用終濃度為0.1%的SDS在65℃與底物DNA溫育10min。

6.連接效率不高

1. 連接緩沖液已變質(zhì)。
2. 限制性內(nèi)切酶在連接混合物中仍具活性。
3. 非特異性的核酸酶污染。
4. 連接酶濃度太低。

對(duì)策：

1. 用新鮮的連接緩沖液重新進(jìn)行連接反應(yīng)。
2. 如果限制性內(nèi)切酶在65℃溫育下熱穩(wěn)定，酶切后應(yīng)該用酚來去除去蛋白并用乙醇沉淀DNA。
3. 判斷連接反應(yīng)混合物中哪種組分被污染，然后逐一將其替換。
4. 在連接反應(yīng)中增大連接酶的用量（0.3-0.6 Wu/1μg），并同時(shí)使用10%PEG。酶切后用酚抽提底物DNA中的蛋白。

7．質(zhì)粒及其菌株的運(yùn)輸保存
我們?yōu)槟峁┖?正確的基因序列的質(zhì)粒（不少于1ul）、甘油菌（含40%甘油）和穿刺菌各一份。在運(yùn)輸過程中，質(zhì)粒、甘油菌和穿刺菌均須保證低溫運(yùn)輸。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，穿刺菌應(yīng)在0～4℃保存；甘油菌應(yīng)在-70℃以下保存；質(zhì)粒應(yīng)在-20℃以下保存，并盡量避免反復(fù)凍溶。