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間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

2011年05月17日 08:56:06人氣:1210來源:上海莼試生物技術(shù)有限公司

試劑和材料:
1. *培養(yǎng)基:α-MEM:α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含*,無核苷酸或脫氧核苷酸;添加:20%附加L-* 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化,非熱滅活、*100U/ml、*100μg/ml。過濾除菌。儲(chǔ)存于4℃,不超過2周;
2. PBSA;
3. */EDTA;
4. 聚丙烯離心管,15ml和50ml;
5. 塑料組織培養(yǎng)皿,直徑15cm;
6. 塑料微量移液器槍頭,10—1000μl;
7. 0.85%臺(tái)盼藍(lán)鹽溶液;
8. 微量移液器;
9. 改良的Neubauer*

實(shí)驗(yàn)方法:
1. 在培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞中小的、貼壁、紡錘形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞匯合至60%時(shí),對其進(jìn)行處理。如果單層細(xì)胞稀疏,則進(jìn)行繼續(xù)潤洗和更換培養(yǎng)基;
2. 按如下步驟消化單層細(xì)胞;
(1) 用20ml預(yù)熱的PBSA潤洗單層細(xì)胞后,加入5ml*/EDTA;
(2) 將培養(yǎng)皿置于37℃ 2min,在10×放大倍數(shù)視野下觀察單層細(xì)胞。貼壁細(xì)胞應(yīng)正從塑料瓶上脫落;
(3) 將培養(yǎng)皿置于37℃ 2min,再次觀察。重復(fù)觀察直至90%的MSCs已從培養(yǎng)瓶中脫落下來;
(4) 加入5mlCCM,將10ml懸液移至15ml離心管中,500g離心10min;
(5) 離心完畢,棄去上清,每管用1—2ml預(yù)熱的PBSA重懸沉淀。如有必要,混合多管細(xì)胞懸液只進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù);
3. 取10μl細(xì)胞懸液加到10μl臺(tái)盼藍(lán)中,用*進(jìn)行計(jì)數(shù)。合適的細(xì)胞懸液濃度為(2—5)×105個(gè)細(xì)胞/ml,存活率需高于80%。*消化后用于傳代的早期培養(yǎng)物懸液,亦可進(jìn)行集落形成單位(CFU)測定、凍存或分化測定;
4. 將細(xì)胞以50—100個(gè)細(xì)胞/cm的密度接種到培養(yǎng)皿中,保持低密度以保證快速的自我更新和多潛能特性。用預(yù)熱CMM以7×103(zui終濃度為50個(gè)細(xì)胞/cm2)到1×104(zui終濃度為100個(gè)細(xì)胞/cm2)的密度重懸MSCs;
5. 預(yù)備適當(dāng)數(shù)量的15cm培養(yǎng)皿,加入25ml預(yù)熱的CMM;
6. 接種1ml步驟2和3所得的細(xì)胞懸液。來回滑動(dòng)平皿(勿打圈)使細(xì)胞分布均勻。培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中,標(biāo)記為一代細(xì)胞;
7. 培養(yǎng)2—3天后,觀察并評價(jià)形態(tài)。MSCs應(yīng)為小的、紡錘體形狀,頻繁折光的雙聯(lián)體。此為培養(yǎng)良好的MSCs;
8. 從培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基,用20ml預(yù)熱的PBSA潤洗,加入25ml預(yù)熱的新鮮CMM;
9. 每次傳代時(shí)所需的培養(yǎng)皿數(shù)量取決于可以接種的細(xì)胞數(shù)量。方案中的上述體積適用于MSCs接種單個(gè)15cm培養(yǎng)皿。如有需要可按此例擴(kuò)大以接種多個(gè)培養(yǎng)皿;


 

關(guān)鍵詞:移液器 培養(yǎng)箱
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