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大腸桿菌的常規(guī)分離鑒定方法

2011年05月28日 11:39:39人氣:1708來(lái)源:上海銳谷生物科技有限公司

在獸醫(yī)臨診或?qū)嶒?yàn)中,需做分離鑒定的大腸桿菌多限于一些對(duì)畜禽有致病性的菌株,如引起初生幼畜(仔豬、犢牛、羔羊)兼或斷奶豬腹瀉的ETEC菌株、致豬水腫病和幼兔腹瀉以及雞各種大腸桿菌感染癥的病原性菌株。除對(duì)分離菌做生物化學(xué)分型鑒定和血清學(xué)分型鑒定外,還應(yīng)包括對(duì)ETEC黏附素抗原和腸毒素的鑒定,對(duì)水腫病菌株的SLT-Ⅱ有條件時(shí)也可以進(jìn)行測(cè)定。至于對(duì)雞、兔和豬水腫病的菌株的菌毛鑒定且前尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

1.形態(tài)和培養(yǎng)特征
致水腫病和新生仔豬腹瀉的大多數(shù)菌株可呈溶血,在麥康凱瓊脂上形成紅色菌落,伊紅美藍(lán)瓊脂上為中心暗藍(lán)黑色并有綠色金屬閃光的菌落。

2.生化鑒定
凡被檢菌落的細(xì)菌在三糖鐵瓊脂(TST)的反應(yīng)為陽(yáng)性者,在O抗原鑒定為陽(yáng)性或與此同時(shí)進(jìn)行常規(guī)生化項(xiàng)目鑒定亦符合埃希菌屬的生化特性后,方可繼續(xù)作進(jìn)一步血清學(xué)定型和毒性因子測(cè)定。
已知有97%分離出的大腸桿菌產(chǎn)生葡萄糖苷酸酶,此酶能使葡萄糖苷酸-4-甲基傘形花烯(MUG)分解而生成熒光性甲基傘形花酮,可用作快速檢測(cè)。Thompson(1990)的快速法可于2Omin內(nèi)完成。將應(yīng)試大腸桿菌培養(yǎng)于哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)(Oxoid,含5%的綿羊血),在36℃孵育18-24h。
MUG試劑:4-甲基傘形花烯寸-D葡萄糖苷酸1OOmg,蒸餾水1OOml,三通(TritoxX-1OO)2滴,待*溶化,用O.45tzm孑L徑濾膜行濾過(guò)滅菌,儲(chǔ)于無(wú)菌玻瓶?jī)?nèi),在冰箱中可保存6月。在冰箱中溶液清澄,在室溫中微濁。
試驗(yàn):用6mmX 5Omm試管作培養(yǎng)。滴2-3滴(約0.5m1)MUG試劑于試管中,加熱到室溫,用一無(wú)菌接種棒刮下一部分純培養(yǎng)物在MUG試劑中乳化,使呈乳樣懸劑。在44.5℃水浴中孵育2Omin,此溫度可產(chǎn)生zui強(qiáng)反應(yīng);但在22~44.5℃之間均可有滿意的反應(yīng)。次用高強(qiáng)度長(zhǎng)波長(zhǎng)(366nm)紫外線燈在暗室內(nèi)檢視,置試管于光源下15cm處,易于觀察。陽(yáng)性者發(fā)出青色熒光。
同樣原理,葡萄糖苷酸亦可和其他各種產(chǎn)熒光性試劑結(jié)合,供檢測(cè)葡萄糖苷酶酸酶。

3.血清型鑒定
大腸桿菌目前有164個(gè)O抗原(O1~O171)、72個(gè)K抗原(K1~K1O3)和55個(gè)H抗原(H1~H57),已發(fā)現(xiàn)的血清型至少有幾千種。因此,該菌的血清型鑒定是以O(shè)抗原、K抗原、H抗原三種抗原作為基礎(chǔ)的,對(duì)ETEC菌株還必須增做黏附素抗原的鑒定。鑒于ETEC和EPEC均常局限于少數(shù)O抗原群,且前者的O抗原群又與黏附素及腸毒素之間存在一定的相關(guān)性。
因此通常對(duì)動(dòng)物ETEC和豬水腫病及禽大腸桿菌病的菌株可先確定其O抗原型,然后做*的血清型鑒定。鑒定O抗原的抗血清必須用單因子抗()血清,以免發(fā)生交叉反應(yīng)。若使用非單因子血清應(yīng)以試管凝集的反應(yīng)結(jié)果來(lái)判定。

4。ETEC毒力因子的鑒定
和幼畜腹瀉有關(guān)的大腸桿菌分離物在上述生化和血清型(至少是O抗原)鑒定證實(shí)為本菌后,再鑒定其是否具有黏附素抗原和腸毒素。對(duì)腸毒素的鑒定可根據(jù)黏附素與腸毒素關(guān)系選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。通常,牛、羊源菌原只產(chǎn)ST,而豬源菌株多產(chǎn)LT和ST。鑒定黏附素的方法很多,一般實(shí)驗(yàn)室多用玻板凝集試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)、ELISA和MRHA及其抑制試驗(yàn)等方法。鑒定腸毒素的方法常用的為兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)或仔豬小腸結(jié)扎試驗(yàn)、兔皮膚藍(lán)斑試驗(yàn)以及平板免疫溶血試驗(yàn)等。對(duì)ST的動(dòng)物試驗(yàn)只有乳鼠胃內(nèi)投服試驗(yàn)可用。豬水腫病菌株的SLT-Ⅱ的鑒定目前仍以Vero細(xì)胞測(cè)定法為主。
 

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