Oligo在分子生物學研究、臨床診斷和藥物治療方面很重要，而對于實驗成功與否，選擇適當?shù)姆椒兓疧ligo其實是十分關(guān)鍵的。

一、為什么要純化？

Oligo有機化學原理是利用結(jié)合于固相載體（CPG）上的核甘酸作為3'端*個核甘酸與另一個受保護的去氧核甘酸在催化劑催化下進行縮合反應(yīng)，隨后在氧化脫去5'端保護基DMT后，再與第三個受保護的去氧核甘酸縮合，如此循環(huán)達到合成Oligo之目的，縮合合成結(jié)束后再利用氨解方法脫去Oligo上之保護基。一般A、C鹼基通常採用苯甲醯基保護，G鹼基採用異丁醯基保護，亞磷酸採用氰乙基保護，T鹼基則不保護。目前固相合成Oligo均在DNA合成儀上進行。前述方法合成之Oligo在氨解脫去保護基后含有大量雜質(zhì)，純度極低。其主要雜質(zhì)為脫下的保護基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨以及氰磷基上脫下的氰乙基等，以致粗產(chǎn)物中Oligo含量僅約15%左右。粗產(chǎn)物中另一雜質(zhì)則為合成時產(chǎn)生的短鏈。儘管目前合成方法的每一次縮合反應(yīng)效率均可達97%以上，但累積效率并不高。以長度為20鹼基和50鹼基之Oligo為例，97.5%的二十次方約為60%，97.5%的五十次方則只有28%。因此，在粗產(chǎn)物中目標Oligo的含量甚至連10%都不到。前述雜質(zhì)，尤其是存在于粗產(chǎn)物中的大量短鏈與鹽，不但造成定量不準確，而且有礙下一步的反應(yīng)，故而Oligo的純化并不是可有可無的步驟，而是*的工作。

二、選擇什么方法純化Oligo？

近年來，合成Oligo的儀器確實有了很大的進步，但其成就主要集中在成功率提升與試劑消耗降低等方面，從化學合成原理上來看，粗產(chǎn)物中大量短鏈與鹽的存在仍然無法避免。雖然未經(jīng)純化的Oligo仍能用于一般PCR反應(yīng)，但成功率較低。一般來說，除用戶特別要求外，代為合成Oligo的公司大多不提供未經(jīng)純化之Oligo粗產(chǎn)物，其純化Oligo的方法約可歸納為下列四類：

1. 脫鹽：常用的方法有下述三種

A. 酒精沉淀。粗產(chǎn)物中的氨鹽等雜質(zhì)可溶于酒精，而Oligo在適當鹽濃度下不溶于酒精。此一方法脫鹽十分簡便，但回收產(chǎn)率較低，尤其是較短的Oligo。大多數(shù)Oligo合成公司採用此法脫鹽。

B. 分子篩。粗產(chǎn)物中的鹽可利用Oligo和鹽分子量的差別而分離，但此一方法操作複雜，并不理想。

C. RPC柱。反相柱脫鹽方法是較理想的脫鹽方法，其原理是利用Oligo可專一性地吸附于RPC柱上而達到脫鹽目的。

2. OPC柱純化

OPC柱純化Oligo的原理是利用保留于5'端的DMT保護基可專一性地吸附于OPC柱上，而短鏈Oligo由于沒有DMT保護基，不易被OPC柱吸附，從而達到脫鹽純化的目的。使用此一方法純化之Oligo適用于一般PCR或要求較高之PCR反應(yīng)。但使用此一方法純化之Oligo常溷有少一到二個鹼基之短鏈，因此并不適于基因合成和DNA定序之用，另外此一方法亦不適于純化大于40個鹼基之Oligo，產(chǎn)率較低。

3. HPLC純化

HPLC純化方法和OPC柱純化方法在原理上頗為接近，也是利用5'端DMT保護基與其他不帶保護基的Oligo在管柱上吸附能力不同達成分離純化的目的，然而由于採用HPLC儀器，其純化效果優(yōu)于OPC柱純化。只要Oligo長度不超過40個鹼基，用HPLC純化的Oligo可用于PCR反應(yīng)、基因合成和DNA定序。但HPLC方法不適于純化超過40個鹼基之Oligo，在此狀況下，雖然目標Oligo帶有5'端DMT保護基，其與不帶DMT保護基的短鏈在管柱上之吸附能力差異不大，因此分辨率降低，純化之Oligo常含有缺少幾個鹼基的短鏈。此外，本法對G鹼基較多之Oligo也不適用。若採用本法純化已脫去DMT保護基之Oligo，由于其留置時間僅反映其表面疏水性，不易用以判斷Oligo之長短。

4. PAGE純化

聚丙烯醯氨凝膠電泳（PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是利用電場作用下Oligo泳動速率差異分離純化樣品。由于同時利用靜電作用與分子篩效應(yīng)，并可採取提高分辨率的變性手段，PAGE方法具有*之分辨率，長度僅相差0.2%（即500個鹼基中的1個鹼基）的DNA分子即可分辨。從凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求zui高的實驗。PAGE純化方法是純化效果*的方法，使用此一方法純化的Oligo可用于任何分子生物學實驗，包括PCR反應(yīng)、基因合成和DNA定序等。PAGE純化對于Oligo長度幾乎沒有限制，即使長達上百個鹼基之Oligo也能清楚分辨幾個鹼基的差異。

雖然PAGE純化之效果*，但一般很少採用此一方法純化。其主要原因為此一方法非常費時、費人工，并有毒害，因此十分昂貴。一般採用此法純化一股Oligo，除基本費用外，仍需加收800至1200元純化費，以往許多實驗室只在進行少數(shù)要求較高實驗，如基因合成和DNA定序時採用此一方法。但在需要大量高品質(zhì)Oligo進行實驗時，採用此法顯然成本過高。生工公司為協(xié)助研究單位能以有限的經(jīng)費完成更高水準的實驗，經(jīng)與國外合作廠商反覆協(xié)調(diào)，終于爭取到約為市面行情1/3之PAGE純化價格，希望能讓研究單位有更多的機會採用此一效果*的純化方法。生工公司國外合作廠商目前推出之PAGE純化方桉結(jié)合PAGE與RPC柱純化，先用PAGE純化去除短鏈Oligo，再用RPC柱純化，效果優(yōu)于其他公司採用之單一PAGE純化。

原文地址:/biotech/exp/TechArticle/2011/f819561566.html