1、RNA降解

A、新鮮細胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細胞，一定要使裂解液能覆蓋住細胞。

B、新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品（如肝臟，胸腺等），即使使用電動勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時使用更多裂解液。

C、冷凍樣品：樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70℃冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細胞，如果不在液氮條件下研磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預冷，在碾磨過程中要及時補充液氮。樣品研碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。

D、外源RNA酶的污染：試劑，器械及實驗環(huán)境中的RNA酶進入實驗系統(tǒng)。

E、內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多；勻漿時溫度過高。

2、OD260/280比值偏低

A、蛋白質(zhì)殘留

使用酚氯仿抽提，去除殘留的蛋白質(zhì)（但經(jīng)此步驟操作，約損失40%的RNA）。

B、鹽分殘留

加入2.5倍體積的無水乙醇和終濃度是0.1M的NaCl沉淀RNA，-20℃放置30分鐘充分沉淀RNA，然后4℃下10,000×g離心15分鐘收集沉淀，溶于DEPC處理過的水中。

C、設備限制

測定OD260及OD280數(shù)值時，使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性。用水稀釋樣品：測OD值時，對照及樣品稀釋液請使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導致比值偏低。

3、RNA提取得率低

A、使用樣品過多，超過吸附柱的zui大結合量

使用過多的樣品，將會導致RNA的降解。

B、Wash Buffer中未加入無水乙醇

使用前，需在DNA Wash Buffer和DNAse I Stop Buffer 中加入無水乙醇。

C、洗脫不正確

加入洗脫Buffer后，放置2~3分鐘在進行離心洗脫。

D、處理樣品太多

減少處理樣品的量。

E、樣品中RNA本身含量低

增加樣品用量和裂解液用量。

F、電泳檢測時，換用新的電泳緩沖液，并盡量減少電泳時間。

4、基因組污染

A、RT-PCR反應中，使用過量的RNA

減少RT-PCR反應中RNA模板的量至50~100 ng。

B、使用過多的組織

使用過多的組織將會導致大量基因組DNA的污染，減少起始組織樣品的量。大部分組織采用30 mg，或者更少量的組織量不會出現(xiàn)基因組污染。

C、增加裂解緩沖液的用量

D、對有些本身DNA含量過多的樣品，可使用RNAse-Free的DNAse I處理后進行后續(xù)實驗。

4、乙醇殘留

洗脫前應保證乙醇去除干凈，可將吸附柱開蓋離心2分鐘。

5、柱子堵塞

A、裂解不*，或者勻漿不*

減少起始樣品的量，或者增加裂解緩沖液的量，并增加裂解時間。

B、上清中含有沉淀

吸取上清時，小心操作避免吸起沉淀。

原文地址:/biotech/exp/molbio/RNA/2011/w814595934.html