PCR 反應(yīng)的zui大特點是具有較大擴增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。

1、污染原因

(1)標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

(2)PCR 試劑的污染：主要是由于在PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染。

(3)PCR 擴增產(chǎn)物污染。這是PCR 反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題。因為PCR 產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013 拷貝/ml)，遠遠高于PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR 產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，zui可能造成PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

(4)實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

2、污染的監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

對照試驗：

(1)陽性對照：在建立PCR 反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR 陽性對照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100 個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。

(2)陰性對照：每次PCR 實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。②試劑對照：在PCR 試劑中不加模板DNA 或RNA，進行PCR 擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。

(3)重復(fù)性試驗

(4)選擇不同區(qū)域的引物進行PCR 擴增

3、防止污染的方法

(1)合理分隔實驗室：將樣品的處理、配制PCR 反應(yīng)液、PCR 循環(huán)擴增及PCR 產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR 產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。能劃分①標本處理區(qū)；②PCR 反應(yīng)液制備區(qū)；③PCR 循環(huán)擴增區(qū)；④PCR 產(chǎn)物鑒定區(qū)。 其實驗用品及吸樣槍應(yīng)。實驗前應(yīng)將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA 或RNA。

(2)吸樣槍：吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(3)預(yù)混和分裝PCR 試劑：所有的PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(4)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

(5)設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的zui低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

(6)減少PCR 循環(huán)次數(shù)，只要PCR 產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。

(7)選擇質(zhì)量好的Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

4、PCR 污染解決對策

PCR 檢測微量感染因子時，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題。

(1)污染的預(yù)防：進行PCR 操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程，zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

(2)劃分操作區(qū)：目前，普通PCR 尚不能做到單人單管，實現(xiàn)*閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：

a、標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；

b、PCR 擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR 擴增；

c、產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增，產(chǎn)物分析，產(chǎn)物處理。

切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

(3)分裝試劑：PCR 擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA 和其他來源的DNA：

a、PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；

b、引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無PCR 擴增產(chǎn)物區(qū)配制；

c、引物和dNTP 應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。

(三) 實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

a、戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；

b、使用一次性吸頭，嚴禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

c、避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

d、操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的度；

e、zui后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；

f、操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；

g、盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA 的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該，不能交叉使用，尤其是PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；

h、重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。

5、追蹤污染源

如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。

(1)設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR 敏感性*，可以從其它方法(Sourthern 印跡或點雜交等)檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時機對照，即包括PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。

(2)環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。

環(huán)境污染中常見的污染源主要有：

a、模板提取時真空抽干裝置；

b、凝膠電泳加樣器；

c、電泳裝置；

d、紫外分析儀；

e、切膠用刀或*片；

f、離心機；

g、冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1)用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2)0。1ml 去離子水浸泡；3)取5ml 做PCR 實驗；4)電泳檢測結(jié)果。

h、氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設(shè)計新的引物(與原引物無相關(guān)性)。

6、污染處理

(1)環(huán)境污染

a、稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA 脫嘌呤；

b、紫外照射(UV)法：紫外波長(nm)一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時，要考慮PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV 照射僅對500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。UV 照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0。065/堿基，其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA 斷裂等)均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當。如果這些位點( 0。13/堿基)在DNA 分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長度限制的原因。

(2)反應(yīng)液污染

可采用下列方法之一處理：

a、DNase I 法：PCR 混合液(未加模板和Taq 聚合酶)加入0。5U DNase I，室溫反應(yīng)30min 后加熱滅活，然后加入模板和Taq 聚合酶進行正常PCR 擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA 的序列；

b、內(nèi)切酶法：選擇識別4 個堿基的內(nèi)切酶(如Msp I 和Taq I 等)，可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR；

c、紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV 照射法；

d、g 射線輻射法：1。5kGy 的輻射可*破壞0。1ng 基因組DNA，2。0 kGy 可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子，4。0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR 擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA 的。

e、*糖苷酶(UNG)法：由于UV 照射的去污染作用對500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。原理：在PCR 產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解*堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除*，而對RNA 中的*和單一*分子則無任何作用。

f、dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進行PCR 擴增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU 的新的PCR 產(chǎn)物。

g、dU 引物法：合成引物時以dU 代dT，這樣PCR 產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴增。對長片段(1-2kb 以上)的擴增用dUTP 法效率較用dTTP低，而用dU 法就可克服這一缺點。dU 引物將dU 設(shè)計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG 處理可以和PCR 擴增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進行；由于擴增產(chǎn)物中有大量dU 存在，可*消除污染源。需注意的是摻入dUTP 的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進行PCR 產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-(UNG 缺陷)大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG 消化掉。

h、固相捕獲法：用于去除標本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1)用一*標記的單鏈RNA 探針與待擴核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴增區(qū)；2)用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有*探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3)洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA 探針雜交區(qū)域。第2)步的漂洗后可用PCR 檢測以確定標本是否被擴增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。

i、RS-PCR 法(RNA-specific PCR)：也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA 模板的特異性PCR 法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A 區(qū))有2 0 個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0 個核苷酸(C 區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA 與多余引物分開，再用和第二引物(C)以*鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR 循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B 區(qū)和引物C 進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA 或質(zhì)粒DNA 才不會被擴增。

j、抗污染引物法：該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物擴增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。

附錄： 各種堿基符號

在設(shè)計簡并引物或測序時你可能會碰到這樣的符號來表示堿基，到時候不要不知道哦：

B = C or G or T

D = A or G or T

H = A or C or T

K = G or T

M = A or C

N = A or C or G or T

R = A or G

S = C or G

V = A or C or G

W = A or T

Y = C or T