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人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)

2017年07月10日 17:35:14人氣:1434來(lái)源:上海宸功生物技術(shù)有限公司

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關(guān) 鍵 詞淋巴細(xì)胞,分離液
【資料簡(jiǎn)介】

人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

本產(chǎn)品是一種用于分離人外周血淋巴細(xì)胞的無(wú)菌、低內(nèi)毒素水平的密度梯度分離液。其分離原理是根據(jù)血細(xì)胞的密度差異(紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度為1.090 g/mL左右;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075~1.090 g/mL;血小板為 1.030~1.035 g/mL),通過(guò)離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布,從而將淋巴細(xì)胞從人外周血或臍帶血中分離出來(lái)。

產(chǎn)品指標(biāo):

密度 1.077±0.001g/mL

滲透壓 290~350 mOsm/kg H2O

無(wú)菌 0.1μm  濾膜過(guò)濾

保存條件:

本產(chǎn)品對(duì)光敏感,應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存,保質(zhì)期 2 年。無(wú)菌開(kāi)封后,保存于室溫。

操作步驟:

1.取新鮮抗凝全血(EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可)或者去纖維蛋白血液,用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。

2.在離心管中加入適量分離液(當(dāng)稀釋后血液體積小于3mL時(shí),加入3mL分離液;大于等于3mL,加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過(guò)離心管的三分之二,否則會(huì)影響分離效果),將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取血液,然后將血液小心的平鋪于分離液上,因?yàn)閮烧叩拿芏炔町悾瑢⑿纬擅黠@的分層界面。如果樣品較多加樣時(shí)間較長(zhǎng),在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正,F(xiàn)象。)

3.室溫,水平轉(zhuǎn)子500~1000g,離心20~30min(血液的體積越大所需的離心力越大,離心時(shí)間越長(zhǎng),更好的分離條件需摸索,離心轉(zhuǎn)速zui大不超過(guò)1200g)。 

4.離心后將出現(xiàn)明顯的分層:zui上層是稀釋的血漿層,中間是透明的分離液層,血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細(xì)胞層,離心管底部是紅細(xì)胞與粒細(xì)胞。

5.小心的吸取白膜層細(xì)胞到15mL潔凈的離心管中, 10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。250g,離心10min。

6.棄上清,5mLPBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞,250g,離心10min。

7.重復(fù)步驟6

8.棄上清,細(xì)胞重懸備用。

分離純度:

使用人淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞的分離純度大于90%

注意事項(xiàng):

  • 開(kāi)封前顛倒混勻,本分離液為無(wú)菌產(chǎn)品,為延長(zhǎng)分離液保存時(shí)間,請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌條件下啟封,避免微生物污染。。
  • 分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫(18~25℃),如室內(nèi)溫度較低,可將分離液預(yù)熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心,可能會(huì)導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。
  • 血液樣本為新鮮抗凝血(采血2 h以?xún)?nèi)),為保持淋巴細(xì)胞的活性,應(yīng)避免冷凍和冷藏。
  • 稀釋血液或洗滌細(xì)胞,不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液,其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集,大大降低細(xì)胞得率及純度。
  • 部分塑料制品(如聚苯乙烯)因其帶有的靜電作用,可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁,影響分離效果。
  • 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異,可能會(huì)影響分離效果,可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間,摸索更好的分離條件。
  • 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加;吸取過(guò)多的血漿層可能會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞中血漿蛋白及血小板污染。
  • 如果要進(jìn)一步對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),那在收集血液和分離過(guò)程中,注意無(wú)菌操作,避免微生物污染。
  • 不同動(dòng)物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同,用戶(hù)在制定分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱(chēng)。

 

上海宸功生物技術(shù)有限公司作者

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